Summary

生物発光イメージングを用いたマウスにおける尿路感染症の縦方向のフォローアップとその治療

Published: June 14, 2021
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Summary

本稿では、生体発光イメージングを用いた細菌負荷の解析とその後の縦方向インビボ解析を行うルクスオペロンを用いた泌尿器内細菌の脳内投与について説明する。

Abstract

尿路感染症(UTI)は、ヒトで最も一般的な細菌感染症の中でランク付けされ、日常的に経験的抗生物質で治療されています。しかし、微生物耐性の増加により、最も使用される抗生物質の効力は低下している。代替治療オプションを見つけるためには、UTIの病因とUTI感受性を決定するメカニズムをよりよく理解する必要があります。これを動物モデルで調べるには、UTIの経過を研究するための再現性のある非侵襲的なアッセイが不可欠である。

何年もの間、細菌負荷の列挙のためのゴールドスタンダードは、特定のサンプル体積のコロニー形成単位(CFU)の決定であった。この技術は 、事後臓器 の均質化と連続希釈を必要とし、データ出力と再現性を制限する。代替として、生物発光イメージング(BLI)は、細菌の負荷を決定するために人気を集めています。 ルクス オペロンで病原体を標識することで、非侵襲的な方法での感受性検出と定量を可能にし、それによって縦方向のフォローアップを可能にする。これまでのところ、UTI研究におけるBLIの採用は依然として限られています。

本稿では、マウス尿路感染モデルにおけるBLIの実用的な実施について説明する。ここでは、細菌を培養するためのステップバイステップガイド、脳内吸込みおよびイメージングが提供される。CFUと の生体内 相関を調べ、抗生物質処理動物と未感染動物の細菌負荷を比較することによって概念実証を提供する。さらに 、in vivo UTI モデルにおける BLI の実装に特有の利点、制限、および考慮事項について説明します。UTI研究分野におけるBLIの導入は、UTIの病因とUTIの予防・治療方法の発見に関する研究を大きく促進します。

Introduction

尿路感染症(UTI)は、ヒトで最も一般的な細菌感染症の一つです。全女性のほぼ半数が生涯に対して症状のUTIを経験する1.膀胱に限られた感染症は、尿頻度の増加、緊急性、血尿、失禁、痛みなどの尿症状を引き起こす可能性があります。感染が上部尿路に上昇すると、患者は倦怠感、発熱、悪寒、背中の痛みで腎盂腎炎を発症する。さらに、UTI患者の最大20%が再発性感染症に苦しむことで、抗生物質感受性2、3、4が劇的に低下する。近年、再発性UTIの治療・予防に対する新しい治療法への関心が高まっています。下尿路の先天的および適応的免疫と、浸潤および植民地化に必要な細菌毒性因子の理解が良いにもかかわらず、治療体制における根本的な変化は毎日の泌尿器科的実践2に翻訳されていない。生体内でUTIの病因と感受性を研究するためには、再現性と非侵襲的なアッセイが不可欠です。

複数の動物のUTIモデルは線虫から霊長類までまで記述されてきたが、マウスモデルは主に5,6用いる。このモデルは、(雌)マウスの経尿道カテーテル法及びそれに続く細菌懸濁液の植え付け、最も一般的には尿病性大腸菌(UPEC)からなる、膀胱管腔7に直接入る。接種後、細菌負荷は、コロニー形成単位(CFU)を決定することによって伝統的に定量化されてきた。この技術は、死後の臓器の均質化および連続希釈を得るために動物を犠牲にする必要があり、データ出力および再現性を制限する。また、個々の動物における細菌負荷の縦方向のフォローアップは、この技術を用いることは不可能である。

1995年、Tagtagらは生きている動物の病気プロセスを監視するために生物発光タグ付き病原体の使用を示唆した8,9.それ以来、髄膜イメージング(BLI)は、髄膜炎、心内膜炎、骨髄炎、皮膚、軟部組織感染症などの多数の感染モデルに適用されてきた。マウスUTIモデルでは、フォトルフドゥス・ルミネセンスから完全なルクス・オペロン(luxCDABE)を有するUPEC株を13個使用することができる。酵素反応は、酸素の存在下で還元フラビンモノヌクレオチドと反応する長鎖アルデヒドの酸化に依存する細菌ルシファーゼによって触媒され、酸化フラビン、長鎖脂肪酸及び光12を生じる。ルクスオペロンは、基質の合成に必要なルシファーゼおよび他の酵素をコードする。したがって、全ての代謝活性菌は、外因性基質12の注入を必要とせずに青色緑色(490nm)の光を連続的に放出する。ルクスタグ付き細菌によって放出される光子は、非常に敏感で冷却された電荷結合装置(CCD)カメラを使用して捕獲することができる。

UTIのモデルでの生物発光細菌の使用は、CFU決定のためのフォローアップ中に一定の時点で動物を犠牲にする必要性を省略し、細菌負荷の縦方向、非侵襲的な定量を可能にする。可能性の広い範囲にもかかわらず、他の分野でのこのBLI技術の堅牢性とUTIの古典的なモデルよりもその利点のための証拠を蓄積し、それは広くUTI研究で実装されていません。ここで紹介するプロトコルは、詳細なステップバイステップガイドを提供し、将来のUTI研究におけるBLIの利点を強調しています。

Protocol

すべての動物実験は、欧州連合共同体理事会のガイドラインに従って実施され、KUルーヴェンの動物倫理委員会(P158/2018)によって承認されました。 1. 細菌の培養(7から適応,13,14) 準備 実験ニーズに最も適した発光UPEC株を選択してください。注:ここでは、臨床膀胱炎分離株、UTI89(大腸…

Representative Results

インビボ BLIは、インスティレーション時のインノキュラムのCFUと相関する。生体内でのBLIの検出限界および接種のCFUとの相関を評価するために、マウスは陰性対照としてUTI89−ルクスおよびPBSの異なる濃度で感染した。植え付けの前に、未感染動物をスキャンして、バックグラウンド発光を決定した。その後の画像は、即時の後の植え付け(<str…

Discussion

CFUカウントと比較したBLIの利点
縦方向データ
CFUを数えて微生物の負担を定量化する伝統的な方法の大きな欠点は、 死後 の臓器ホモジナートの要件であり、動物1人につき1つの断面データポイントのみを提供する。逆に、BLIは、感染した動物の非侵襲的な縦方向のフォローアップを可能にする。動物は1日2〜3回画像化することができ、感染の運動に関する詳細な洞察?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、研究財団フランダース(FWOヴラアンデレン)からの助成金によって支えられました。G0A6113N、KUルーヴェンの研究評議会(C1-TRPLe;T.V. および W.E. )VIB (T.V.へ)。W.E.は、研究財団フランダース(FWO Vlaanderen)の上級臨床研究者です。UTI89-ルクス 株は、シード教授の研究室13からの寛大な贈り物でした。

Materials

96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate Corning 3925 for in vitro imaging
Aesculap ISIS Aesculap GT421 hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer Harvard apparatus limited N/A https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL Bayer N/A Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA BD 382912 Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice Janvier N/A
Centrifuge 5804R Eppendorf EP022628146
Dropsense 16 Unchained Labs Trinean to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco ThermoFisher Scientific REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L VWR international 85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap Corning 352057
Falcon 50ml cellstart Greiner 227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL Sigma-Aldrich 26203 to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop Roth 6174.1 holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g Dechra Veterinary products N/A Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer REF 124262 imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL Sigma-Aldrich CAS 25389-94-0
Living Imaging Software PerkinElmer N/A BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth Sigma-Aldrich REF L3022 alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar Sigma-Aldrich REF L2897 alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm ThermoFisher Scientific 101VR20 to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL Sigma-Aldrich SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean Unchained Labs 701-2007 to measure OD 600nm
UTI89-lux N/A N/A Generous gift from Prof. Seed
Vortex VWR international 444-1372

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Luyts, N., Vande Velde, G., Vanneste, M., De Bruyn, H., Janssens, A., Verstraeten, N., Voets, T., Everaerts, W. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (172), e62614, doi:10.3791/62614 (2021).

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