Summary

Suivi longitudinal des infections des voies urinaires et leur traitement chez la souris à l’aide de l’imagerie par bioluminescence

Published: June 14, 2021
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Summary

Ce manuscrit décrit l’administration intravésicale de bactéries uropathogènes avec un opéron lux pour induire une infection des voies urinaires chez la souris et l’analyse longitudinale in vivo ultérieure de la charge bactérienne à l’aide de l’imagerie par bioluminescence.

Abstract

Les infections des voies urinaires (IVU) se classent parmi les infections bactériennes les plus courantes chez l’homme et sont systématiquement traitées avec des antibiotiques empiriques. Cependant, en raison de l’augmentation de la résistance microbienne, l’efficacité des antibiotiques les plus utilisés a diminué. Pour trouver d’autres options de traitement, il est très nécessaire de mieux comprendre la pathogenèse des infections urinaires et les mécanismes qui déterminent la susceptibilité aux infections urinaires. Afin d’étudier cela dans un modèle animal, un test reproductible et non invasif pour étudier l’évolution de l’infection urinaire est indispensable.

Pendant des années, l’étalon-or pour le dénombrement de la charge bactérienne a été la détermination des unités formant des colonies (UFC) pour un volume d’échantillon particulier. Cette technique nécessite des homogénats d’organes post-mortem et des dilutions en série, ce qui limite la production de données et la reproductibilité. Comme alternative, l’imagerie par bioluminescence (BLI) gagne en popularité pour déterminer la charge bactérienne. Le marquage des agents pathogènes à l’aide d’un opéron lux permet la détection et la quantification sensibles de manière non invasive, permettant ainsi un suivi longitudinal. Jusqu’à présent, l’adoption de l’BLI dans la recherche sur les infections urinaires reste limitée.

Ce manuscrit décrit la mise en œuvre pratique de BLI dans un modèle d’infection des voies urinaires chez la souris. Ici, un guide étape par étape pour la culture des bactéries, l’instillation intravésicale et l’imagerie est fourni. La corrélation in vivo avec l’UFC est examinée et une preuve de concept est fournie en comparant la charge bactérienne d’animaux infectés non traités avec des animaux traités aux antibiotiques. En outre, les avantages, les limites et les considérations spécifiques à la mise en œuvre de BLI dans un modèle d’infection urinaire in vivo sont discutés. La mise en œuvre de l’BLI dans le domaine de la recherche sur les infections urinaires facilitera grandement la recherche sur la pathogenèse des infections urinaires et la découverte de nouvelles façons de prévenir et de traiter les infections urinaires.

Introduction

Les infections des voies urinaires (IVU) sont parmi les infections bactériennes les plus courantes chez l’homme. Près de la moitié des femmes connaîtront une infection urinaire symptomatique au cours de leur vie1. Les infections limitées à la vessie peuvent donner lieu à des symptômes urinaires tels qu’une augmentation de la fréquence urinaire, l’urgence, l’hématurie, l’incontinence et la douleur. Lorsque l’infection monte dans les voies urinaires supérieures, les patients développent une pyélonéphrite, avec malaise, fièvre, frissons et maux de dos. En outre, jusqu’à 20% des patients atteints d’infections urinaires souffrent d’infections récurrentes entraînant une diminution spectaculaire de la sensibilité aux antibiotiques2,3,4. Au cours des dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour les nouvelles thérapies pour le traitement et la prévention des infections urinaires récurrentes. Malgré une meilleure compréhension de l’immunité innée et adaptative des voies urinaires inférieures et des facteurs de virulence bactérienne nécessaires à l’invasion et à la colonisation, aucun changement radical dans le régime de traitement n’a été traduit dans la pratique urologique quotidienne2. Afin d’étudier la pathogenèse et la susceptibilité aux infections urinaires in vivo,un test reproductible et non invasif est indispensable.

Plusieurs modèles d’infection urinaire animale ont été décrits allant des nématodes aux primates, mais le modèle murin est principalement utilisé5,6. Ce modèle consiste en un cathétérisme transurétral de souris (femelles) et l’instillation ultérieure d’une suspension bactérienne, le plus souvent escherichia coli uropathogène (UPEC), directement dans la lumière de la vessie7. Après l’inoculation, la charge bactérienne a traditionnellement été quantifiée en déterminant les unités formant des colonies (UFC). Cette technique nécessite de sacrifier des animaux pour obtenir des homogénats d’organes post-mortem et des dilutions en série, ce qui limite la production de données et la reproductibilité. De plus, le suivi longitudinal de la charge bactérienne chez les animaux individuels n’est pas possible en utilisant cette technique.

En 1995, Contag et al. ont suggérél’utilisation d’agents pathogènes marqués au bioluminescent pour surveiller les processus pathologiques chez les animaux vivants8,9. Depuis lors, l’imagerie par bioluminescence (BLI) a été appliquée à de nombreux modèles d’infection tels que la méningite, l’endocardite, l’ostéomyélite, les infections de la peau et des tissus mous, etc.10,11,12. Dans le modèle UTI murin, une souche UPEC avec l’opéron lux complet(luxCDABE)de Photorhabdus luminescens peut être utilisée13. Une réaction enzymatique est catalysée par la luciférase bactérienne qui dépend de l’oxydation des aldéhydes à longue chaîne réagissant avec le mononucléotide de flavine réduit en présence d’oxygène, donnant la flavine oxydée, un acide gras à longue chaîne et la lumière12. L’opéron lux code pour la luciférase et d’autres enzymes nécessaires à la synthèse des substrats. Par conséquent, toutes les bactéries métaboliquement actives émettront continuellement de la lumière bleu-vert (490 nm) sans avoir besoin de l’injection d’un substrat exogène12. Les photons émis par les bactéries marquées luxpeuvent être capturés à l’aide de caméras CCD (Charge-Coupled Device) refroidies très sensibles.

L’utilisation de bactéries bioluminescentes dans un modèle d’infection urinaire permet la quantification longitudinale et non invasive de la charge bactérienne, en omettant la nécessité de sacrifier des animaux à des moments fixes pendant le suivi de la détermination de l’UFC. Malgré le large éventail de possibilités, l’accumulation de preuves de la robustesse de cette technique BLI dans d’autres domaines et de ses avantages par rapport aux modèles classiques d’infection urinaire, elle n’a pas été largement mise en œuvre dans la recherche sur les infections urinaires. Le protocole présenté ici fournit un guide détaillé étape par étape et met en évidence les avantages de BLI pour toutes les futures recherches sur les infections urinaires.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices du Conseil communautaire de l’Union européenne et ont été approuvées par le comité d’éthique animale de la KU Leuven (P158/2018). 1. Cultiver des bactéries (adaptées de7,13,14) Préparation Choisissez une variété UPEC luminescente qui correspond le mieux aux besoins expérimen…

Representative Results

In vivo BLI est en corrélation avec l’UFC de l’inoculum au moment de l’instillation.Pour évaluer la limite de détection de BLI in vivo et la corrélation avec l’UFC de l’inoculum, des souris ont été infectées par différentes concentrations d’UTI89-lux et de PBS comme témoin négatif. Avant l’instillation, les animaux non infectés ont été scannés pour déterminer la luminescence de fond. Les images suivantes ont été obtenues imm?…

Discussion

Avantages de BLI par rapport au nombre d’UFC
Données longitudinales
Un inconvénient majeur de la méthode traditionnelle de comptage de l’UFC pour quantifier la charge microbienne est l’exigence d’homogénats d’organes post-mortem, ne fournissant qu’un seul point de données transversale par animal. Inversement, BLI permet un suivi longitudinal non invasif des animaux infectés. Les animaux peuvent être photographiés 2 à 3 fois par jour, fournissant un aperçu détaillé d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation pour la recherche – Flandre (FWO Vlaanderen; G0A6113N), le Conseil de recherche de la KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. et W.E.) et le VIB (à la télévision). W.E. est chercheur clinique senior de la Research Foundation – Flanders (FWO Vlaanderen). La souche UTI89-lux était un don généreux du laboratoire du professeur Seed13.

Materials

96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate Corning 3925 for in vitro imaging
Aesculap ISIS Aesculap GT421 hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer Harvard apparatus limited N/A https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL Bayer N/A Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA BD 382912 Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice Janvier N/A
Centrifuge 5804R Eppendorf EP022628146
Dropsense 16 Unchained Labs Trinean to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco ThermoFisher Scientific REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L VWR international 85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap Corning 352057
Falcon 50ml cellstart Greiner 227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL Sigma-Aldrich 26203 to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop Roth 6174.1 holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g Dechra Veterinary products N/A Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer REF 124262 imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL Sigma-Aldrich CAS 25389-94-0
Living Imaging Software PerkinElmer N/A BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth Sigma-Aldrich REF L3022 alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar Sigma-Aldrich REF L2897 alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm ThermoFisher Scientific 101VR20 to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL Sigma-Aldrich SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean Unchained Labs 701-2007 to measure OD 600nm
UTI89-lux N/A N/A Generous gift from Prof. Seed
Vortex VWR international 444-1372

References

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Luyts, N., Vande Velde, G., Vanneste, M., De Bruyn, H., Janssens, A., Verstraeten, N., Voets, T., Everaerts, W. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (172), e62614, doi:10.3791/62614 (2021).

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