שימוש באלקטרופורציה לאחר הלידה של In Vivo לחקר מורפולוגיה של נוירון גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסה
Summary
כאן אנו מתארים שיטה לדמיין סינפטוגנזה של נוירונים גרגיריים במוח הקטן של העכבר במהלך הזמן של התפתחות המוח לאחר הלידה, כאשר תאים אלה משכללים את המבנים הסינפטיים שלהם ויוצרים סינפסות כדי לשלב את עצמם במעגל המוח הכולל.
Abstract
תאי עצב עוברים שינויים דינמיים במבנה ובתפקוד שלהם במהלך התפתחות המוח כדי ליצור קשרים מתאימים עם תאים אחרים. המוח הקטן של המכרסם הוא מערכת אידיאלית למעקב אחר התפתחות ומורפוגנזה של סוג תא יחיד, נוירון הגרגיר הקטן (CGN), לאורך זמן. כאן, אלקטרופורציה in vivo של אבות נוירונים גרגיריים במוח הקטן המתפתח של עכבר שימשה כדי לתייג תאים בדלילות עבור ניתוחים מורפולוגיים הבאים. יעילותה של טכניקה זו מודגמת ביכולתה להציג שלבי התפתחות מרכזיים של הבשלת CGN, תוך התמקדות ספציפית בהיווצרות טפרים דנדריטיים, שהם מבנים מיוחדים שבהם תאים אלה מקבלים את רוב הקלט הסינפטי שלהם. בנוסף לאספקת תמונות של מבנים סינפטיים של CGN במהלך התפתחות המוח הקטן, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת למניפולציה גנטית של נוירונים גרגיריים באופן אוטונומי של התא כדי לחקור את תפקידו של כל גן מעניין ואת השפעתו על מורפולוגיה של CGN, התפתחות טופרים וסינפטוגנזה.
Introduction
התפתחות המוח היא תהליך ממושך המשתרע מאמבריוגנזה לחיים שלאחר הלידה. במהלך הזמן הזה, המוח משלב שילוב של גירויים פנימיים וחיצוניים שמפסלים את החיווט של סינפסות בין דנדריטים ואקסונים כדי בסופו של דבר לכוון התנהגות. המוח הקטן המכרסם הוא מערכת מודל אידיאלית לחקר התפתחות הסינפסות מאחר שניתן לעקוב אחר התפתחותו של סוג נוירון יחיד, נוירון הגרגיר הקטן (CGN), כשהוא עובר מתא אב לתא עצב בוגר. זה נובע, בין השאר, מהעובדה שרוב קליפת המוח הקטן מתפתחת לאחר הלידה, מה שמאפשר מניפולציה גנטית קלה ותיוג תאים לאחר הלידה1.
ביונקים, התמיינות CGN מתחילה בסוף ההתפתחות העוברית כאשר תת-קבוצה של תאים מתרבים במוח האחורי נודדת מעל השפה המעוינת ויוצרת אזור נבט משני על פני המוח הקטן 2,3,4. למרות שהם מחויבים באופן מלא לזהות אב נוירון גרגיר (GNP), תאים אלה ממשיכים להתרבות בתוך החלק החיצוני של שכבת הגרגיר החיצונית (EGL) עד היום שלאחר הלידה 14 (P14). התפשטות שכבה זו גורמת להתרחבות מסיבית של המוח הקטן מכיוון שתאים אלה יוצרים באופן בלעדי CGNs5. ברגע ש-CGNs שזה עתה נולדו יוצאים ממחזור התא ב-EGL, הם נודדים פנימה לכיוון שכבת הגרגיר הפנימית (IGL), ומשאירים אחריהם אקסון שיתפצל וינוע בשכבה המולקולרית של המוח הקטן, ויוצר סיבים מקבילים שסינפסות על תאי Purkinje6. מיקומם של סיבים אלה בתוך השכבה המולקולרית תלוי בתזמון היציאה של מחזור התא.
CGNs שמתמיינים ראשונים משאירים את הסיבים המקבילים שלהם לכיוון תחתית השכבה המולקולרית, בעוד שהאקסונים של CGNs שמתמיינים מאוחר יותר מקובציםב-7,8 העליונים. ברגע שגופי תאי CGN מגיעים ל-IGL, הם מתחילים לפרט דנדריטים וליצור סינפסות עם נוירונים מעכבים ומעוררים סמוכים. העץ הדנדריטי הבוגר של CGN מציג ארכיטקטורה סטריאוטיפית עם ארבעה תהליכים עיקריים. במהלך הבשלת CGN, המבנים בקצה הדנדריטים הללו יוצרים טופר המועשר בחלבונים פוסט-סינפטיים 9,10. מבנים מיוחדים אלה, הנקראים טפרים דנדריטיים, מכילים את רוב הסינפסות על תאי עצב גרגיריים והם חשובים לקבלת קלט מעורר מעצבובים של סיבי טחב שמקורם בפונס, כמו גם קלט מעכב מתאי גולג’י מקומיים. לאחר ההגדרה המלאה, הקשרים הסינפטיים של CGNs מאפשרים לתאים אלה להעביר קלט מגרעיני קדם-המוח הקטן לתאי Purkinje, אשר מקרינים מתוך קליפת המוח הקטן אל גרעיני המוח הקטן העמוקים.
אלקטרופורציה לאחר הלידה של תל”ג לאחר הלידה היא יתרון על פני שיטות אחרות מבוססות תיוג, כגון זיהום ויראלי ויצירת קווי עכברים טרנסגניים, מכיוון שניתן להשיג את הביטוי של מבנים רצויים על ציר זמן מהיר, והשיטה מכוונת לאוכלוסייה קטנה של תאים, שימושי בחקר השפעות אוטונומיות של תאים. שיטה זו שימשה במחקרים קודמים לחקר התפתחות מורפולוגית של CGNs; עם זאת, מחקרים אלה התמקדו בנקודת זמן אחת או בחלון זמן קצר 9,10,11,12,13. שיטת תיוג זו שולבה עם ניתוח תמונה כדי לתעד את השינויים במורפולוגיית CGN המתרחשים לאורך כל מהלך התמיינות CGN במהלך שלושת השבועות הראשונים לחיים שלאחר הלידה. נתונים אלה חושפים את הדינמיקה של התפתחות דנדריט CGN העומדת בבסיס בניית מעגלים צרבלריים.
Protocol
Representative Results
Discussion
נוירוני גרגיר המוח הקטן הם תאי העצב הנפוצים ביותר במוח היונקים, ומהווים כמעט 60-70% מכלל אוכלוסיית תאי העצב במוח המכרסם 1,14. המוח הקטן נמצא בשימוש נרחב כדי להבהיר מנגנונים של התפשטות תאים, נדידה, היווצרות דנדריטים והתפתחות סינפסות 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי מענקי NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.), ותוכנית הקיץ למדעי המוח של אוניברסיטת דיוק (D.G).
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. . Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
- Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
- Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
- Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
- Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
- Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
- Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070 (2014).
- Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
- Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12 (2010).
- Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
- Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
- Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
- Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), 4970-4981 (1995).
- Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
- Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561 (2018).
- Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, 70-74 (1993).
- Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
- Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neuroscience. 162 (3), 723-731 (2009).
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
