Verwendung der postnatalen In-vivo-Elektroporation zur Untersuchung der Morphologie von Kleinhirngranula-Neuronen und der Synapsenentwicklung
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung der Synaptogenese von Körnerneuronen im Kleinhirn der Maus über den zeitlichen Verlauf der postnatalen Gehirnentwicklung, wenn diese Zellen ihre synaptischen Strukturen verfeinern und Synapsen bilden, um sich in den gesamten Gehirnkreislauf zu integrieren.
Abstract
Neuronen verändern sich während der Entwicklung des Gehirns dynamisch in ihrer Struktur und Funktion, um geeignete Verbindungen zu anderen Zellen zu bilden. Das Kleinhirn von Nagetieren ist ein ideales System, um die Entwicklung und Morphogenese eines einzelnen Zelltyps, des Kleinhirngranula-Neurons (CGN), im Laufe der Zeit zu verfolgen. Hier wurde die In-vivo-Elektroporation von Körnerneuronen-Vorläuferzellen im sich entwickelnden Kleinhirn der Maus eingesetzt, um Zellen für nachfolgende morphologische Analysen spärlich zu markieren. Die Wirksamkeit dieser Technik zeigt sich in ihrer Fähigkeit, wichtige Entwicklungsstadien der CGN-Reifung aufzuzeigen, mit besonderem Schwerpunkt auf der Bildung von dendritischen Klauen, bei denen es sich um spezialisierte Strukturen handelt, in denen diese Zellen den Großteil ihrer synaptischen Inputs erhalten. Diese Technik liefert nicht nur Momentaufnahmen von CGN-Synapsenstrukturen während der gesamten Kleinhirnentwicklung, sondern kann auch angepasst werden, um Körnerneuronen zellautonom genetisch zu manipulieren, um die Rolle eines Gens von Interesse und seine Auswirkungen auf die CGN-Morphologie, die Klauenentwicklung und die Synaptogenese zu untersuchen.
Introduction
Die Entwicklung des Gehirns ist ein langwieriger Prozess, der sich von der Embryogenese bis ins postnatale Leben erstreckt. Während dieser Zeit integriert das Gehirn eine Kombination aus intrinsischen und extrinsischen Reizen, die die Verdrahtung von Synapsen zwischen Dendriten und Axonen formen, um letztendlich das Verhalten zu steuern. Das Kleinhirn von Nagetieren ist ein ideales Modellsystem, um zu untersuchen, wie sich Synapsen entwickeln, da die Entwicklung eines einzelnen Neuronentyps, des Kleinhirn-Körner-Neurons (CGN), beim Übergang von einer Vorläuferzelle zu einem reifen Neuron verfolgt werden kann. Dies ist zum Teil auf die Tatsache zurückzuführen, dass sich ein Großteil der Kleinhirnrinde postnatal entwickelt, was eine einfache genetische Manipulation und Zellmarkierung nach der Geburt ermöglicht1.
Bei Säugetieren beginnt die CGN-Differenzierung am Ende der Embryonalentwicklung, wenn eine Untergruppe proliferativer Zellen im Hinterhirn über die rhombische Lippe wandert, um eine sekundäre Keimzone auf der Oberfläche des Kleinhirns zu bilden 2,3,4. Obwohl sie vollständig an eine Granule Neuron Progenitor (GNP)-Identität gebunden sind, vermehren sich diese Zellen bis zum postnatalen Tag 14 (P14) im äußeren Teil der äußeren Körnerschicht (EGL) weiter. Die Proliferation dieser Schicht führt zu einer massiven Ausdehnung des Kleinhirns, da diese Zellen ausschließlich CGNs5 hervorbringen. Sobald neugeborene CGNs den Zellzyklus in der EGL verlassen, wandern sie nach innen in Richtung der inneren Körnerschicht (IGL) und hinterlassen ein Axon, das sich in der molekularen Schicht des Kleinhirns gabelt und wandert und parallele Fasern bildet, die auf Purkinje-Zellen synapsieren6. Die Position dieser Fasern innerhalb der Molekülschicht hängt vom Zeitpunkt des Zellzyklusaustritts ab.
CGNs, die sich zuerst differenzieren, verlassen ihre parallelen Fasern zum unteren Rand der Molekülschicht, während die Axone von CGNs, die sich später differenzieren, oben 7,8 gruppiert sind. Sobald die CGN-Zellkörper das IGL erreichen, beginnen sie, Dendriten zu entwickeln und Synapsen mit nahe gelegenen inhibitorischen und exzitatorischen Neuronen zu bilden. Der ausgereifte dendritische Baum eines CGN weist eine stereotype Architektur mit vier Hauptprozessen auf. Im Laufe der CGN-Reifung bilden die Strukturen am Ende dieser Dendriten eine Klaue, die mit postsynaptischen Proteinen angereichert wird 9,10. Diese spezialisierten Strukturen, dendritische Klauen genannt, enthalten die Mehrheit der Synapsen auf Körnerneuronen und sind wichtig, um sowohl exzitatorische Inputs von moosigen Faserinnervationen aus den Pons als auch inhibitorische Inputs von lokalen Golgi-Zellen zu erhalten. Einmal vollständig konfiguriert, ermöglichen die synaptischen Verbindungen von CGNs diesen Zellen, Eingaben von präzerebellären Kernen an Purkinje-Zellen weiterzuleiten, die aus der Kleinhirnrinde in die tiefen Kleinhirnkerne projizieren.
Die postnatale In-vivo-Elektroporation von GNPs ist vorteilhaft gegenüber anderen markierungsbasierten Methoden, wie z. B. Virusinfektion und Erzeugung transgener Mauslinien, da die Expression gewünschter Konstrukte auf einer schnellen Zeitachse erreicht werden kann und die Methode auf eine kleine Population von Zellen abzielt, was bei der Untersuchung zellautonomer Effekte nützlich ist. Diese Methode wurde in früheren Studien verwendet, um die morphologische Entwicklung von CGNs zu untersuchen. Diese Studien konzentrierten sich jedoch entweder auf einen einzelnen Zeitpunkt oder ein kurzes Zeitfenster 9,10,11,12,13. Diese Markierungsmethode wurde mit einer Bildanalyse gepaart, um die Veränderungen in der CGN-Morphologie zu dokumentieren, die über den gesamten zeitlichen Verlauf der CGN-Differenzierung in den ersten drei Wochen des postnatalen Lebens auftreten. Diese Daten zeigen die Dynamik der Entwicklung von CGN-Dendriten, die dem Aufbau von Kleinhirnschaltkreisen zugrunde liegt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kleinhirngranula-Neuronen sind die am häufigsten vorkommenden Neuronen im Säugetiergehirn und machen fast 60-70% der gesamten Neuronenpopulation im Nagetiergehirnaus 1,14. Das Kleinhirn wurde ausgiebig genutzt, um Mechanismen der zellulären Proliferation, Migration, Dendritenbildung und Synapsenentwicklung aufzuklären 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) und das Summer Neuroscience Program (D.G.) der Duke University unterstützt.
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
References
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