メラノーマのBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルにおける超高周波超音波イメージングによるリンパ節容積の解析
Summary
メラノーマは、すぐに他の臓器に広がる非常に攻撃的な病気です。このプロトコルは、転移性黒色腫のBraf/Ptenマウスモデルにおける鼠径リンパ節の体積を監視するために、3Dレンダリングと組み合わせた超高周波超音波イメージングの適用を説明する。
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox遺伝子操作マウス(Braf/Ptenマウス)は、転移性黒色腫のin vivoモデルとして広く使用されている。原発性腫瘍がタモキシフェン治療によって誘導されると、誘導後4〜6週間以内に転移性負荷の増加が観察される。この論文は、超高周波超音波(UHFUS)イメージングを利用して、鼠径リンパ節の体積の増加を測定することによって、鼠径リンパ節の転移性関与の増加を監視する方法を示す。
UHFUSシステムは、UHFUSリニアプローブ(22-55MHz、軸分解能40μm)で麻酔マウスをスキャンするために使用されます。鼠径リンパ節(左右両側)からのBモード画像は、短軸ビューで取得され、動物を背側臥位に位置決めする。超音波記録は、電動機械式アームの44μmステップサイズを使用して取得されます。その後、2次元(2D)Bモード取得が超音波画像後処理用のソフトウェアプラットフォームにインポートされ、取得した断面2D画像において鼠径リンパ節が識別され、半自動的にセグメント化される。最後に、3次元(3D)体積の全再構成が、リンパ節体積のレンダリングとともに自動的に得られ、これも絶対測定値として表される。
この非侵襲的な in vivo 技術は、非常に忍容性が高く、同じ実験動物上で2週間にわたって複数のイメージングセッションをスケジュールすることができます。したがって、転移性疾患に対する薬理学的治療の影響を評価することが理想的である。
Introduction
メラノーマは、しばしば他の皮膚部位(皮下転移)だけでなく、リンパ節、肺、肝臓、脳、骨にも広がる攻撃的な形態の皮膚癌です1。過去10年間で、新薬が臨床現場に導入され、転移性黒色腫患者の平均余命の改善に貢献してきました。しかし、応答までの時間や程度の変動、重篤な副作用、獲得した抵抗の反乱など、限界が残っています1。したがって、転移性の広がりを初期段階、すなわち局所リンパ節に到達したときに検出することが重要です。
局所リンパ節(センチネルリンパ節)の生検は、通常、黒色腫細胞の存在を確認するために行われる。しかし、超音波イメージングは、臨床評価を凌駕し、不必要な生検を回避するのに役立つため、転移性関与を検出する非侵襲的な方法として定着しています2,3,4。さらに、超音波画像は、リンパ節の監視、特に高齢および/または併存疾患の場合に適切であると思われる5,6。超音波分析によって検出され、正常リンパ節と転移性リンパ節の区別を可能にする特徴は、サイズ(体積)の増加、楕円形から円形への形状の変化、不規則なマージン、エコー発生パターンの変化、および変化した(増加した)血管新生7。
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox遺伝子操作マウス(Braf/Ptenマウス)は、転移性黒色腫の組織特異的で誘導可能なモデルとして最近科学界に利用可能になりました8。この動物モデルでは、原発性腫瘍は非常に迅速に発症する:野生型(wt)BrafからBrafV600Eへの切り替えおよびPtenの喪失の誘導後2〜3週間以内に目に見えるようになり、4週間以内に50〜100mm3の体積に達する。次の2週間で、原発性腫瘍の増殖は、他の皮膚部位、リンパ節、および肺における転移性負荷の漸進的な増加を伴う。
Braf/Ptenマウスは、メラノーマ発生に関与するシグナル伝達経路の解剖9,10、起源のメラノーマ細胞の同定11,12,13、標的療法と免疫療法の両方の観点からの新しい治療選択肢の試験など、複数の目的で広く使用されています8,14,15,16。.具体的には、Braf/Ptenマウスを用いて、弱毒化リステリア・モノサイトゲネス(Lmat)が抗黒色腫ワクチンとして作用することを実証した。治療環境で全身投与した場合、Lmatは腫瘍部位に選択的に蓄積するため、全体的な毒性とは関連しない。さらに、原発性黒色腫量の顕著な減少およびリンパ節および肺における転移性負荷の減少を引き起こす。分子レベルでは、Lmatはメラノーマ細胞のアポトーシス死滅を引き起こし、これは少なくとも部分的には、非細胞自律活性(CD4+およびCD8+ Tリンパ球の部位での動員)に起因する16。
Braf/Ptenマウスをメラノーマモデリングに使用すると、原発性腫瘍および皮下転移の増殖をノギス測定によってモニターすることができる。しかし、リンパ節と肺の関与は、代替技術、おそらく研究者が時間の経過とともに同じ動物を追跡できる非侵襲的な技術を使用して調査する必要があります。この論文では、鼠径リンパ節のサイズ(体積)の増加の縦断的モニタリングのための、得られたデータのその後の3D体積分析と相まって、超音波イメージング(図1)の使用について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究で得られたデータは、転移性黒色腫のBraf/Ptenマウスモデルの鼠径リンパ節の転移性関与を監視する超音波イメージングの能力を証明している。前に示したように16、この技術は、薬物治療の有効性を評価するのに特に有用である。これは、t1および t2で収集された測定値をt0で収集された測定値と比較することによって、同じ動物に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、動物の処置に関する彼女の支援について、S. Burchielli(FTGM、Pisa)に感謝したい。この作業は、LPへのISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologicaの機関資金によって支援されました。MFAG #17095 AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro が LP に授与。
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
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