Analyse des Lymphknotenvolumens mittels Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung im gentechnisch veränderten Mausmodell des Melanoms von Braf/Pten
Summary
Melanom ist eine sehr aggressive Krankheit, die sich schnell auf andere Organe ausbreitet. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebung in Verbindung mit 3D-Rendering zur Überwachung des Volumens der Leistenlymphknoten im Braf/Pten-Mausmodell des metastasierenden Melanoms.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox gentechnisch veränderte Mäuse (Braf/Pten-Mäuse) werden häufig als In-vivo-Modell für metastasierendes Melanom verwendet. Sobald ein Primärtumor durch die Behandlung mit Tamoxifen induziert wurde, wird innerhalb von 4-6 Wochen nach der Induktion ein Anstieg der metastatischen Belastung beobachtet. Dieses Papier zeigt, wie die Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) -Bildgebung genutzt werden kann, um die Zunahme der metastatischen Beteiligung der Leistenlymphknoten zu überwachen, indem die Zunahme ihres Volumens gemessen wird.
Das UHFUS-System dient zum Scannen von betäubten Mäusen mit einer UHFUS-Linearsonde (22-55 MHz, axiale Auflösung 40 μm). B-Mode-Bilder von den Leistenlymphknoten (sowohl linke als auch rechte Seite) werden in einer Kurzachsenansicht aufgenommen, in der die Tiere im dorsalen Liegebereich positioniert werden. Ultraschallaufzeichnungen werden mit einer Schrittgröße von 44 μm an einem motorisierten mechanischen Arm erfasst. Anschließend werden zweidimensionale (2D) B-Mode-Aufnahmen in die Softwareplattform für die Nachbearbeitung von Ultraschallbildern importiert und Leistenlymphknoten in den erfassten Querschnitts-2D-Bildern halbautomatisch identifiziert und segmentiert. Schließlich wird automatisch eine vollständige Rekonstruktion des dreidimensionalen (3D) Volumens zusammen mit der Darstellung des Lymphknotenvolumens erhalten, die auch als absolute Messung ausgedrückt wird.
Diese nicht-invasive In-vivo-Technik ist sehr gut verträglich und ermöglicht die Planung mehrerer Bildgebungssitzungen am selben Versuchstier über 2 Wochen. Es ist daher ideal, um die Auswirkungen der pharmakologischen Behandlung auf metastasierende Erkrankungen zu bewerten.
Introduction
Melanom ist eine aggressive Form von Hautkrebs, die sich oft auf andere Hautstellen (subkutane Metastasen) sowie auf Lymphknoten, Lunge, Leber, Gehirn und Knochen ausbreitet1. In den letzten zehn Jahren wurden neue Medikamente in die klinische Praxis eingeführt und haben dazu beigetragen, die Lebenserwartung von Patienten mit metastasierendem Melanom zu verbessern. Es bleiben jedoch Einschränkungen bestehen, einschließlich der variablen Reaktionszeit und des Grades des Ansprechens, schwerer Nebenwirkungen und des Aufruhrs erworbener Resistenzen1. Daher ist es wichtig, die metastatische Ausbreitung in ihren frühen Stadien zu erkennen, d.h. wenn sie zu den lokalen Lymphknoten gelangt.
Eine Biopsie der lokalen Lymphknoten (Sentinellymphknoten) wird normalerweise durchgeführt, um das Vorhandensein von Melanomzellen zu überprüfen. Die Ultraschallbildgebung setzt sich jedoch als nicht-invasive Methode zur Erkennung metastasierender Beteiligung durch, da sie die klinische Bewertung übertrifft und dazu beitragen kann, eine unnötige Biopsie zu vermeiden2,3,4. Darüber hinaus scheint die Ultraschallbildgebung für die Lymphknotenüberwachung geeignet zu sein, insbesondere bei fortgeschrittenem Alter und/oder Komorbiditäten5,6. Zu den Merkmalen, die durch Ultraschallanalyse erkannt werden und die Unterscheidung zwischen normalen und metastasierenden Lymphknoten ermöglichen, gehören eine erhöhte Größe (Volumen), eine Formänderung von oval zu rund, ein unregelmäßiger Rand, ein verändertes echogenes Muster und eine veränderte (erhöhte) Vaskularisation7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox gentechnisch veränderte Mäuse (Braf/Pten-Mäuse) wurden kürzlich der wissenschaftlichen Gemeinschaft als gewebespezifisches und induzierbares Modell für metastasierendes Melanom zur Verfügung gestellt8. In diesem Tiermodell entwickeln sich Primärtumoren sehr schnell: Sie werden innerhalb von 2-3 Wochen nach der Induktion des Wechsels von Wildtyp (wt) Braf zu BrafV600E und des Verlustes von Pten sichtbar, während sie innerhalb von 4 Wochen ein Volumen von 50-100 mm3 erreichen. In den folgenden 2 Wochen wird das Wachstum des Primärtumors von einer fortschreitenden Zunahme der metastatischen Belastung an anderen Hautstellen, Lymphknoten und Lungen begleitet.
Braf/Pten-Mäuse wurden in großem Umfang für verschiedene Zwecke verwendet, einschließlich der Sezierung von Signalwegen, die an der Melanomagese beteiligt sind9,10, der Identifizierung von Melanomzellen der Herkunft11,12,13 und der Erprobung neuer therapeutischer Optionen sowohl in Bezug auf die zielgerichtete Therapie als auch auf die Immuntherapie8,14,15,16 . Insbesondere verwendeten wir Braf / Pten-Mäuse, um zu zeigen, dass abgeschwächte Listeria monocytogenes (Lmat) als Anti-Melanom-Impfstoff wirken. Bei systemischer Verabreichung im therapeutischen Umfeld ist Lmat nicht mit der Gesamttoxizität assoziiert, da es sich selektiv an Tumorstellen ansammelt. Darüber hinaus verursacht es eine bemerkenswerte Abnahme der primären Melanommasse und eine Verringerung der metastatischen Belastung in den Lymphknoten und Lungen. Auf molekularer Ebene verursacht Lmat eine apoptotische Abtötung von Melanomzellen, die zumindest teilweise auf nicht-zellautonome Aktivitäten zurückzuführen ist (Rekrutierung von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten vor Ort)16.
Wenn Braf/Pten-Mäuse für die Melanommodellierung verwendet werden, kann das Wachstum von Primärtumoren und subkutanen Metastasen durch Messschiebermessungen überwacht werden. Die Beteiligung von Lymphknoten und Lungen muss jedoch mit einer alternativen Technik untersucht werden, möglicherweise einer nicht-invasiven, die es Forschern ermöglicht, dasselbe Tier im Laufe der Zeit zu verfolgen. Dieses Papier beschreibt die Verwendung der Ultraschallbildgebung (Abbildung 1), gekoppelt mit einer anschließenden volumetrischen 3D-Analyse der erhaltenen Daten, für die longitudinale Überwachung der Zunahme der Größe (des Volumens) von Leistenlymphknoten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in dieser Studie erhaltenen Daten belegen die Fähigkeit der Ultraschallbildgebung, die metastatische Beteiligung der Leistenlymphknoten des Braf/Pten-Mausmodells des metastasierenden Melanoms zu überwachen. Wie bereits gezeigt16, ist diese Technik besonders nützlich, um die Wirksamkeit der medikamentösen Behandlung zu beurteilen. Dies liegt daran, dass es die Überwachung der Veränderung des Lymphknotenvolumens bei demselben Tier im Laufe der Zeit ermöglicht, indem die bei t1 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken S. Burchielli (FTGM, Pisa) für ihre Unterstützung bei Tierverfahren. Diese Arbeit wurde von ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutionelle Finanzierung von LP unterstützt; MFAG #17095 verliehen von AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro an LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma – Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
