В данной работе представлен метод разработки, характеристики и отслеживания в режиме реального времени метастазирования опухоли в модели нейробластомы рыбок данио, в частности в трансгенной линии рыбок данио с гиперэкспрессией MYCN и LMO1, которая развивает метастазирование спонтанно.
Рыбки данио стали важной животной моделью для изучения заболеваний человека, особенно рака. Наряду с надежными трансгенными технологиями и технологиями редактирования генома, применяемыми в моделировании рыбок данио, простота обслуживания, высокая продуктивность и мощная живая визуализация в целом делают рыбок данио ценной модельной системой для изучения метастазов и клеточных и молекулярных основ, лежащих в основе этого процесса in vivo. Первая модель метастазирования нейробластомы рыбок данио (NB) была разработана путем сверхэкспрессии двух онкогенов, MYCN и LMO1, под контролем промотора дофамина-бета-гидроксилазы (dβh). Ко-сверхэкспрессированные MYCN и LMO1 приводили к снижению латентности и усилению пенетрантности нейробластомагенеза, а также ускорению отдаленного метастазирования опухолевых клеток. Эта новая модель достоверно повторяет многие ключевые особенности метастатического НБ человека, включая участие клинически значимых и связанных с метастазами генетических изменений; естественное и спонтанное развитие метастазов in vivo; и сохраненные участки метастазов. Поэтому модель рыбок данио обладает уникальными преимуществами для рассечения сложного процесса метастазирования опухоли in vivo.
Рыбки данио широко используются и применяются в нескольких областях исследований, особенно при раке. Эта модель предоставляет множество преимуществ, таких как ее надежное размножение, экономически эффективное поддержание и универсальная визуализация роста опухоли и метастазирования – все это делает рыбок данио мощным инструментом для изучения и исследования клеточных и молекулярных основ опухолевого генеза и метастазирования. Новые методы крупномасштабного картирования генома, трансгенеза, сверхэкспрессии или нокаута генов, трансплантации клеток и химических экранов значительно увеличили мощность модели рыбок данио1. За последние несколько лет было разработано много линий рыбок данио для изучения опухолевого генеза и метастазирования различных видов рака человека, включая, но не ограничиваясь, лейкемией, меланомой, рабдомиосаркомой и гепатоцеллюлярной карциномой2,3,4,5. Кроме того, первая модель нейробластомы рыбок данио (NB) была получена путем сверхэкспрессии MYCN, онкогена, в периферической симпатической нервной системе (PSNS) под контролем промотора дофамина-бета-гидроксилазы (dβh). С помощью этой модели было дополнительно продемонстрировано, что активированный ALK может синергировать с MYCN для ускорения начала опухоли и увеличения пенетрантности опухоли in vivo6.
NB получен из симпатоадреналовой линии клеток нервного гребня и является высокометастатическим раком у детей7. Он ответственен за 10% детских смертей, связанных с раком8. Широко метастазируемый при постановке диагноза, NB может быть клинически представлен как опухоли, в основном происходящие по цепочке симпатических ганглиев и мозгового вещества надпочечников PSNS9,10. Амплификация MYCN обычно связана с плохими исходами у пациентов с NB11,12. Кроме того, LMO1 был идентифицирован как критический ген чувствительности к NB в случаях высокого риска13,14. Исследования показали, что трансгенная коэкспрессия MYCN и LMO1 в PSNS модели рыбок данио не только способствует более раннему началу NB, но и индуцирует широко распространенные метастазы в ткани и органы, которые похожи на участки, обычно наблюдаемые у пациентов с высоким риском NB13. Совсем недавно другой метастатический фенотип NB также наблюдался в более новой модели NB рыбок данио, в которой как MYCN, так и Lin28B, кодирующие РНК-связывающий белок, чрезмерно экспрессируются под контролем промотора dβh16.
Стабильный трансгенный подход у рыбок данио часто используется для изучения того, может ли чрезмерная экспрессия интересующего гена способствовать нормальному развитию и патогенезу заболевания14,15. Этот метод был успешно использован для демонстрации важности нескольких генов и путей к опухолевому NB 6,16,17,18,19,20. В этой статье будет представлено, как была создана трансгенная рыбья линия, которая чрезмерно экспрессирует как MYCN, так и LMO1 в PSNS, и как было продемонстрировано, что сотрудничество этих двух онкогенов ускоряет начало опухолевого NB и метастазирования13. Во-первых, трансгенная линия, которая сверхэкспрессирует EGFP-MYCN под контролем промотора dβh (обозначенная линией MYCN), была разработана путем инъекции конструкции dβh-EGFP-MYCN в одноклеточную стадию эмбрионов AB дикого типа (WT), как описано ранее6,17. Отдельная трансгенная линия, которая сверхэкспрессирует LMO1 в PSNS (обозначенная линией LMO1), была разработана путем коинъекции двух конструкций ДНК, dβh-LMO1 и dβh-mCherry, в эмбрионы WT на стадии одной клетки13. Ранее было продемонстрировано, что коинъекционные двойные конструкции ДНК могут быть коинтегрированы в геном рыбы; поэтому LMO1 и mCherry совместно экспрессируются в клетках PSNS трансгенных животных. Как только введенные эмбрионы F0 достигали половой зрелости, их затем скрещивали с рыбой WT для идентификации положительных рыб с интеграцией трансгенов. Короче говоря, потомство F1 было впервые проверено флуоресцентной микроскопией на экспрессию mCherry в клетках PSNS. Интеграция зародышевой линии LMO1 у mCherry-положительных рыб была дополнительно подтверждена геномной ПЦР и секвенированием. После успешной идентификации каждой трансгенной линии потомство гетерозиготных трансгенных рыб MYCN и LMO1 скрещивалось для получения составной рыбной линии, экспрессирующей как MYCN, так и LMO1 (обозначенный MYCN; Линия LMO1). Опухоленосный MYCN; Рыбу LMO1 контролировали с помощью флуоресцентной микроскопии раз в две недели на предмет наличия метастатических опухолей в областях, удаленных от первичного участка, области межпочечной железы (IRG, эквивалент надпочечников человека)13. Для подтверждения метастазирования опухолей в MYCN; Применены рыбный LMO1, гистологический и иммуногистохимический анализы.
Рыбки данио широко использовались в исследованиях в течение последних нескольких десятилетий, особенно в исследованиях рака, по очевидным причинам, таким как простота обслуживания, надежное размножение и явные преимущества для визуализации in vivo1,28.</sup…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом R01 CA240323 (S.Z.) от Национального института рака; грант W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) от Министерства обороны США (DOD); награда V Scholar от V Фонда исследований рака (S.Z.) и грант платформы от Центра биомедицинских открытий Майо (S.Z.); и поддержка со стороны Онкологического центра клиники Майо и Центра индивидуализированной медицины (S.Z.).
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |