신경 모세포종 전이의 제브라피시 모델
Summary
본 논문은 신경모세포종의 제브라피시 모델에서 종양 전이를 실시간으로 개발, 특성화 및 추적하는 방법을 소개하며, 특히 MYCN 및 LMO1의 과발현을 가진 형질형 제브라피시 라인에서 자발적으로 전이를 발생시합니다.
Abstract
Zebrafish는 인간 질병, 특히 암을 연구하는 중요한 동물 모델로 부상했습니다. Zebrafish 모델링에 적용된 강력한 형질 전환 및 게놈 편집 기술과 함께 유지 보수의 용이성, 고수량 생산성 및 강력한 라이브 이미징은 모두 제브라피쉬를 생체 내에서 이 공정의 기초에 기초한 전이 및 세포 및 분자 기지를 연구하는 귀중한 모델 시스템으로 만듭니다. 전이의 첫번째 제1 제브라피시 신경모세포종 (NB) 모형은 도파민 베타-하이드록실라제 (dβh) 프로모터의 통제하에, 2개의 종양유전자, MYCN 및 LMO1를 과보로 해서 개발되었습니다. CO-표현 된 MYCN 및 LMO1 신경 모세포종 발생의 감소 된 대기 시간 및 증가 침투뿐만 아니라 종양 세포의 가속 먼 전이로 이어졌다. 이 새로운 모델은 임상적으로 관련되고 전이 연관된 유전 적 변경의 참여를 포함하여 인간 전이성 NB의 많은 주요 특징을 안정적으로 반복합니다. 생체 내에서 전이의 자연적이고 자발적인 발달; 전이의 보존 사이트. 따라서, 제브라피쉬 모델은 생체내에서 종양 전이의 복잡한 과정을 해부하는 독특한 장점을 갖는다.
Introduction
Zebrafish는 널리 사용되고 연구의 여러 영역에 적용되었습니다, 특히 암에서. 이 모델은 강력한 생식, 비용 효율적인 유지 보수 및 종양 성장 및 전이의 다목적 시각화와 같은 많은 이점을 제공하며, 이 중 제브라피쉬는 종양 발생 및 전이의 세포 및 분자 기지를 연구하고 조사할 수 있는 강력한 도구로 만듭니다. 대규모 게놈 매핑, 전염, 유전자 과발성 또는 녹아웃, 세포 이식 및 화학 스크린을 위한 새로운 기술은 제브라피시 모델1의 힘을 대단히 증강시켰습니다. 지난 몇 년 동안, 많은 얼룩말 물고기 라인은 백혈병, 흑색종, rhabdomyosarcoma, 및 간세포 암에 국한되지 않는 다양한 인간 암의 종양 발생 및 전이를 연구하기 위하여 개발되었습니다2,3,4,5. 또한, 신경모세포종(NB)의 제1 제1 제1 제보브라시모델은 도파민-베타-하이드록실라제(dβh) 프로모터를 통제하에 있는 말초 교감 신경계(PSNS)에서 종양유전자인 MYCN을 과발현함으로써 생성되었다. 이 모델로, 활성화된 ALK가 MYCN과 시너지 효과를 발휘하여 종양 발병을 가속화하고 생체내에서 종양 침투를 증가시킬 수 있음을 더욱 입증되었다.
NB는 신경 문장 세포의 동감 계보에서 파생되고, 어린이의 고이성암이다7. 그것은 소아암 관련 죽음의 10%를 책임집니다8. 진단에서 널리 전이되는, NB는 PSNS9,10의 교감 심정 및 부신 수질의 사슬을 따라 주로 유래하는 종양으로 임상적으로 제시될 수 있습니다. MYCN 증폭은 일반적으로 NB 환자에서 가난한 결과와 연관11,12. 더욱이, LMO1은 고위험 케이스13,14에서 중요한 NB 감수성 유전자로 확인되었습니다. 연구 결과는 제브라피시 모형의 PSNS에 있는 MYCN및 LMO1의 형질전환이 NB의 초기 개시를 승진시킬 뿐 아니라, 또한 고위험 NB13를 가진 환자에서 일반적으로 보인 사이트에 유사한 조직 및 기관에 광범위하게 전이를 유도한다는 것을 것을을 발견했습니다. 아주 최근에, NB의 또 다른 전이성 표현형은 또한 NB의 새로운 제브라피시 모형에서 관찰되고, MYCN과 Lin28B, RNA 결합 단백질을 인코딩하는, dβh promoter16의 통제하에 과발현되는.
제브라피시에 있는 안정한 형질 전환 접근법은 관심있는 유전자의 과발현이 일반적인 발달 및 질병 병인에 기여할 수 있었다는 것을 연구하기 위하여 수시로 이용됩니다14,15. 이 기술은 성공적으로 NB 종양 발생에 여러 유전자와 경로의 중요성을 입증하기 위해 사용되었습니다6,16,17,18,19,20. 이 논문에서는 PSNS에서 MYCN과 LMO1을 과도하게 표현하는 형질전환선이 어떻게 만들어졌는지, 그리고 이 두 종양발생의 협력이 NB 종양발생과 전이의 발병을 가속화한다는 것이 어떻게 입증되었는지소개합니다. 첫째, dβh 프로모터(지정된 MYCN 라인)의 제어하에 EGFP-MYCN을 과발현하는 형질전환선은 dβh-EGFP-MYCN 구조를 야생형(WT) AB 배아의 1세포 단계로 주입하여 개발하였으며, 이는 이전에 설명된 바와 같이 6,17이다. PSNS(지정된 LMO1 라인)에서 LMO1을 과발현하는 별도의 형질전환선은 1세포 13단계에서 WT 배아에 2개의 DNA 구조, dβh-LMO1 및 dβh-mCherry를 주입하여 개발되었다. 이전에는 이중 DNA 구조를 생성하여 물고기 게놈으로 통합될 수 있음을 입증했습니다. 따라서, LMO1 및 mCherry는 형질전환 동물의 PSNS 세포에서 공동 발현된다. 주입 된 F0 배아가 성숙에 도달하면, 그들은 트랜스 진 (들) 통합을 가진 긍정적인 물고기의 식별을 위해 WT 물고기와 교차했습니다. 간단히, F1 자손은 PSNS 세포에서 mCherry 발현에 대한 형광 현미경 검사법에 의해 처음으로 검열되었다. mCherry 양성 물고기에서 LMO1의 세균성 통합은 게놈 PCR 및 시퀀싱에 의해 더 확인되었다. 각 형질전환선의 성공적인 식별 후, 이종구스 MYCN 및 LMO1 형질형 물고기의 자손은 MYCN과 LMO1을 모두 표현하는 복합 어류 라인을 생성하기 위해 교배되었다 (지정된 MYCN; LMO1 라인). 종양 베어링 MYCN; LMO1 물고기는 1 차 부위, 인터신장 영역 (IRG, 인간 부신의 얼룩말 물고기 에 상응하는)에 먼 지역에서 전이성 종양의 증거를 위해 주중 형광 현미경 검사법에 의해 모니터링되었다. MYCN에서 종양의 전이를 확인하려면; LMO1 물고기, 조직학적 및 면역 조직화학 적 분석이 적용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish는 지난 수십 년 동안 연구에서 일반적으로 사용되어 왔으며, 특히 암 연구에서는 유지 보수의 용이성, 견고한 재생산 및 생체 내 이미징1,28에 대한 명확한 이점과 같은 명백한 이유로 사용되었습니다. 제브라피시 모델은 대규모 유전 연구를 위해 쥐와 마우스와 같은 포유류 모형 유기체에 잘 보완하는 그들의 외부 풍부하게 함 및 발달 때?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 암 연구소에서 보조금 R01 CA240323 (S.Z.)에 의해 지원되었다; 미국 국방부(DoD)의 보조금 W81XWH-17-1-0498(S.Z.) V학자상은 V암연구재단(S.Z.)과 마요 생물의학 발견 센터(S.Z.)의 플랫폼 보조금으로 수여됩니다. 메이요 클리닉 암 센터 및 개별 의학 센터 (S.Z.)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
References
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