本协议提供了一个快速和有用的工具,用于评估化疗后在替代拼接调节中具有非同寻常功能的蛋白质的作用。
mRNA 处理涉及多个同时步骤,为翻译准备 mRNA,例如 5’封顶、多 A 添加和拼接。除了构成拼接外,替代mRNA拼接还允许从一个基因中表达多功能蛋白质。由于相互作用研究通常是对新蛋白质或未知蛋白质的第一次分析,诱饵蛋白与拼接因子的关联表明它可以参与mRNA拼接过程,但确定在什么情况下或在什么情况下调节基因是一个经验过程。评估此功能的良好起点是使用经典的迷你基因工具。在这里,我们介绍腺卵巢E1A微型基因的用法,用于评估不同细胞应激刺激后的替代拼接变化。我们评估了E1A微基因在 HEK293 中拼接,经过不同的应力处理后,稳定过度表达 Nek4 蛋白质。该协议包括E1A微基因转染、细胞治疗、RNA提取和cDNA合成,然后是PCR和凝胶分析和E1A拼接变种的量化。使用这种简单和成熟的方法与特定的治疗相结合是一个可靠的起点,可以揭示细胞过程或哪些基因可以通过mRNA拼接调节。
拼接是真核 mRNA 处理中最重要的步骤之一,同时发生到 5mRNA 封顶和 3mRNA 聚腺化,包括内电拆除,然后是外向结。拼接点 (SS) 的识别由拼接体, 核糖核蛋白复合物包含小核糖核蛋白 (snRNP U1, U2, U4 和 U6), 小RNA (snRNA) 和几个调节蛋白1 是拼接的必要条件。
除了内电拆卸(构成拼接),在真核生物中,可以保留内子,可以排除外在,配置称为 mRNA 替代拼接 (AS) 的过程。替代的mRNA前拼接扩展了真核基因组的编码能力,允许从相对较少的基因中产生大量和多样化的蛋白质。据估计,95-100%的含有多个外在物的人类mRNA可以进行替代拼接2,3。这是神经元发育、凋亡活化和细胞应激反应4等生物过程的基础,为生物体提供了利用相同的基因来调节细胞功能的替代方案。
替代拼接所需的机械与构成拼接所用的机械相同,SS 的使用是替代拼接发生的主要决定因素。构成拼接与使用强拼接点有关,通常更类似于拼接体识别5的共识主题。
替代外显子通常比构成外显子识别效率低,一旦其 cis-监管元素,在 5 的 SS 和 3 的 SS 的序列侧翼这些外显子,显示对拼接体的低级绑定能力。mRNA 还包含位于外显子(外显电拼接增强剂 (ESEs) 和外显拼接消音器 (ESS) 和 introns(内电拼接增强器 (ISEs) 和内生拼接消音器 (ISS) 中的指定增强器或消音器的区域,分别增强或抑制外显子的使用。这些序列由跨监管元素或拼接因子 (SF) 识别。SF主要由两种蛋白质家族表示,血清/精氨酸丰富的拼接因子(SRSF)与ESE结合,异质核核核蛋白(hnRNPs)家族与ESS序列5结合。
替代拼接可以通过磷酸化/脱磷的跨因子改变相互作用伙伴和细胞定位拼接因子6,7,8调节。识别拼接因子的新调节器可以提供新的工具来调节拼接,从而提供一些癌症治疗。
Anufrieva等人在mRNA微阵列基因表达特征中观察到101个细胞系中拼接体成分水平和不同应激条件(铂基药物、伽马辐照、托波索酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和分类酶)后的一致变化。拼接模式与化疗疗效的关系已经在肺癌细胞中得到证明,肺癌细胞具有抗化疗作用,显示 caspase-9 变异率10的变化。HEK293细胞用化疗面板治疗显示,随着亲凋零变种的增加,拼接的变化。Gabriel 等人11观察了不同细胞系中经酸铂处理后至少 700 个拼接事件的变化,指出拼接通路受顺铂影响。拼接调制剂已经显示出抗肿瘤活性,表明拼接对肿瘤发育很重要,主要是化疗反应12。因此,描述细胞压力剂剂(如化疗)后调节拼接的新蛋白质对于发现新的治疗策略非常重要。
相互作用研究中替代拼接调节的线索,特别是对描述新蛋白质或非特异性蛋白质的功能非常重要,可能需要一种更通用、更简单的方法来验证蛋白质在AS中的实际作用。微基因是分析影响拼接调节的蛋白质的一般作用的重要工具。它们包含来自兴趣基因的片段,其中包含其他拼接和侧翼基因组区域13。使用微型工具可以分析体内拼接,具有若干优点,例如微小的微基因长度,因此不会限制放大反应:同一微基因可以在不同的细胞系中进行评估;所有细胞组件,主要是其调节后转化修改(磷化和细胞隔间的变化)都存在,可以解决13,14。此外,在细胞应激之后,可以观察到替代拼接模式的变化,并且,使用微型系统,可以识别由不同刺激调节的路径。
有几个迷你基因系统已经描述,这是针对不同类型的拼接事件13,14,然而,作为初步的测定,迷你基因E1A15是一个非常成熟的替代拼接记者系统,用于研究5的SS选择在体内。仅从一个基因,E1A,五个mRNA是由替代拼接的基础上,选择三个不同的5+拼接点和一个主要或一个小的3+拼接站点16,17,18。E1A变异的表达方式根据腺病毒感染期19、20而变化。
我们以前已经表明,Nek4等离子体与拼接因子(如 SRSF1 和 hnRNPA1)相互作用,虽然等形 2 改变了迷你基因 E1A 替代拼接,但等离子体 1 在这21中没有影响。由于等离子体1是最丰富的等形体,并改变化疗阻力和DNA损伤反应,我们评估它是否可以改变微基因E1A替代拼接在应力条件下。
Minigene 检测是一种简单、低成本和快速的方法,因为它只需要 RNA 提取、cDNA 合成、放大和阿加罗斯凝胶分析,并且可以成为一个有用的工具来评估,因为兴趣蛋白质对替代拼接的可能影响,直到不同处理对细胞替代拼接模式的影响。
微基因是确定全球替代拼接在体内的影响的重要工具。腺微基因E1A已经成功地使用了几十年,通过增加这些在细胞13,14中的数量来评估蛋白质的作用。在这里,我们建议使用微型E1A来评估化疗暴露后的替代拼接。使用了表达Nek4等离子体1的稳定细胞线,避免了瞬态瞬态感染引起的过度表达。Nek4的同位素1在基础条件下的微基因E1A替代拼…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢圣保罗埃斯塔多·安帕罗基金会(FAPESP, 通过格兰特·特梅蒂科 2017/03489-1 到 JK 和研究金 FLB 2018/05350-3) 和康塞略国家德森沃尔维托科学公司 (CNPq) 资助这项研究。我们要感谢阿德里安·克雷纳博士提供了pMTE1A质粒和泽勒及其同事在E1A克隆方面所做的工作。我们还要感谢帕特里西亚·莫里尔教授、万达·佩雷拉·阿尔梅达教授、马塞洛·兰斯洛蒂教授和卡琳娜·科戈·科戈·穆勒教授允许我们使用他们的实验室空间和设备。
100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
Agarose | Sigma | A9539-250G | |
Cisplatin | Sigma | P4394 | |
DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
Trypsin | Sigma | T4799 |