يقدم هذا البروتوكول أداة سريعة ومفيدة لتقييم دور البروتين مع وظيفة غير مطهرة في تنظيم الربط البديل بعد العلاج الكيميائي.
تتضمن معالجة الحمض النووي الريبي خطوات متعددة في وقت واحد لإعداد مرنا للترجمة، مثل 5’capping، إضافة متعددة A والربط. وإلى جانب الربط التأسيسي، يسمح الربط البديل من الحمض النووي الريبي بالتعبير عن البروتينات متعددة الوظائف من جين واحد. كما دراسات interactome عموما التحليل الأول للبروتينات الجديدة أو غير معروفة، وارتباط بروتين الطعم مع عوامل الربط هو مؤشر على أنه يمكن أن تشارك في عملية الربط ميرنا، ولكن لتحديد في أي سياق أو ما هي الجينات التي تنظم هي عملية تجريبية. نقطة انطلاق جيدة لتقييم هذه الوظيفة هو استخدام أداة مينيجين الكلاسيكية. هنا نقدم استخدام مينيجين E1A أدينوفيرالي لتقييم التغييرات الربط البديلة بعد محفزات الإجهاد الخلوية المختلفة. قمنا بتقييم الربط من E1A minigene في HEK293 الإفراط في التعبير عن بروتين Nek4 بعد علاجات الإجهاد المختلفة. ويشمل البروتوكول E1A minigene transfection، والعلاج الخلوي، واستخراج الحمض النووي الريبي وتوليف cDNA، تليها PCR وتحليل هلام وتكميم المتغيرات E1A مقسمة. استخدام هذه الطريقة البسيطة والراسخة جنبا إلى جنب مع علاجات محددة هو نقطة انطلاق موثوقة لتسليط الضوء على العمليات الخلوية أو ما هي الجينات التي يمكن تنظيمها عن طريق الربط ميرنا.
الربط هو من بين أهم الخطوات في معالجة الحمض النووي الريبي eukaryotic الذي يحدث في وقت واحد إلى 5’mRNA توج و3’mRNA polyadenylation، تتألف من إزالة intron تليها تقاطع exon. الاعتراف مواقع الربط (SS) من قبل الربط، وهو مجمع ريبونوكليوبروتين تحتوي على البروتينات الريبونوكليوبروتين الصغيرة (snRNP U1، U2، U4 و U6)، والحمض النووي الريبي الصغيرة (snRNAs) والعديد من البروتينات التنظيمية1 ضروري للربط.
إلى جانب إزالة intron (الربط التأسيسي) ، في eukaryotes ، يمكن الاحتفاظ introns ويمكن استبعاد exons ، وتكوين عملية تسمى mRNA الربط البديل (AS). توسيع الربط البديل قبل مرنا القدرة على الترميز من الجينوم eukaryotic السماح لإنتاج عدد كبير ومتنوع من البروتينات من عدد قليل نسبيا من الجينات. وتشير التقديرات إلى أن 95-100٪ من mRNAs الإنسان التي تحتوي على أكثر من exon واحد يمكن أن تخضع للصق بديل2،3. وهذا أمر أساسي للعمليات البيولوجية مثل تطوير الخلايا العصبية، وتنشيط موت الخلايا المبرمج واستجابة الإجهاد الخلوي4،وتوفير بدائل الكائن الحي لتنظيم عمل الخلية باستخدام نفس ذخيرة الجينات.
الآلات اللازمة للربط البديل هي نفسها المستخدمة في الربط التأسيسي واستخدام SS هو المحدد الرئيسي لحدوث الربط البديل. الربط التأسيسي يرتبط باستخدام مواقع الربط القوية ، والتي عادة ما تكون أكثر تشابها مع الزخارف التوافقية للاعتراف باللصق5.
وعادة ما يتم التعرف على exons البديلة أقل كفاءة من exons التأسيسية مرة واحدة في رابطة الدول المستقلة– العناصر التنظيمية ، وتسلسل في 5 SS و 3 SS يحيط هذه exons ، وتظهر قدرة ملزمة أدنى إلى الربط. يحتوي مرنا أيضا على مناطق تسمى القدرة أو كواتم الصوت الموجودة في exons (معززات الربط exonic (ESEs) وكاتم الصوت اللصق exonic (ESSs)) و introns (القدرة على الربط intronic (ISEs) وكاتم الصوت الربط intronic (ISSs)) التي تعزز أو قمع استخدام exon، على التوالي5. يتم التعرف على هذه التسلسلات من خلال العناصر العابرة للتنظيم، أو عوامل الربط (SF). يتم تمثيل SFs بشكل رئيسي من قبل عائلتين من البروتينات ، وعوامل الربط الغنية بالسرين / الأرجينين (SRSFs) التي ترتبط ب ESEs وعائلة البروتينات الريبونوكليوبروتية النووية غير المتجانسة (hnRNPs) التي ترتبط بتسلسل ESSs5.
يمكن تعديل الربط البديل عن طريق الفوسفور / إزالة الفوسفور من العوامل العابرة لتعديل شركاء التفاعلات والتوطين الخلوي لعوامل الربط6و7و8. ويمكن أن يوفر تحديد منظمين جدد لعوامل الربط أدوات جديدة لتنظيم الربط، وبالتالي بعض علاجات السرطان.
أنوفرييفا وآخرون.9, في صورة التعبير الجيني ميكروراي مرنا, لاحظت تغييرات متسقة في مستويات المكونات اللصق في 101 خطوط الخلية وبعد ظروف الإجهاد المختلفة (الأدوية القائمة على البلاتين, تشعيع غاما, مثبطات توبويسوميراز, مثبطات كيناز التيروزين والتكسير). العلاقة بين نمط الربط وفعالية العلاج الكيميائي وقد ثبت بالفعل في خلايا سرطان الرئة, التي هي مقاومة للعلاج الكيميائي, تظهر تغييرات في المتغيرات caspase-9 معدل10. تظهر خلايا HEK293 المعالجة بلوحة العلاج الكيميائي تغييرات في الربط مع زيادة في المتغيرات المؤيدة للبوبتوتيك. ولاحظ غابرييل وآخرون11 تغيرات في ما لا يقل عن 700 حدث من أحداث الربط بعد علاج سيسبلاتين في خطوط الخلايا المختلفة، مشيرا إلى أن مسارات الربط تتأثر سيسبلاتين. وقد أظهرت التشكيلات الربط بالفعل النشاط المضاد للورم، مما يدل على أن الربط مهم للتنمية الورمية، وأساسا، استجابة العلاج الكيميائي12. وبالتالي ، فإن توصيف البروتينات الجديدة التي تنظم الربط بعد عوامل الإجهاد الخلوية ، مثل العلاج الكيميائي ، مهم جدا لاكتشاف استراتيجيات جديدة للعلاج.
يمكن أن تتطلب أدلة تنظيم الربط البديل من دراسات interactome ، ذات الأهمية الخاصة لتوصيف وظائف البروتينات الجديدة أو غير المكصرة ، نهجا أكثر عمومية وبساطة للتحقق من الدور الحقيقي للبروتين في AS. Minigenes هي أدوات هامة لتحليل الدور العام للبروتين التي تؤثر على تنظيم الربط. أنها تحتوي على أجزاء من جين الفائدة التي تحتوي على مناطق الجينوم مقسمة بدلا من ذلك ويحيط13. استخدام أداة minigene يسمح تحليل الربط في الجسم الحي مع العديد من المزايا مثل طول minigene الذي هو طفيف، وبالتالي ليس قيدا على رد فعل تضخيم; يمكن تقييم نفس المينيجين في خطوط الخلايا المختلفة؛ جميع المكونات الخلوية، وأساسا تعديل ما بعد الترجمة تنظيم (الفوسفور والتغيرات في مقصورات الخلية) موجودة ويمكن معالجتها13،14. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة التغيرات في نمط الربط البديل بعد الإجهاد الخلوي، واستخدام نظام مينيجين، تسمح لتحديد المسار الذي يتم تحويره من قبل محفزات مختلفة.
هناك العديد من أنظمة minigene الموصوفة بالفعل والتي هي محددة لأنواع مختلفة من الأحداث الربط13،14، ومع ذلك ، كخبار أولي ، فإن minigene E1A15 هو نظام مراسل الربط البديل الراسخ للغاية لدراسة اختيار 5 SS في الجسم الحي. من جين واحد فقط، E1A، يتم إنتاج خمسة mRNAs بواسطة الربط البديل على أساس اختيار ثلاثة مواقع مختلفة 5′ لصق واحد رئيسي أو واحد طفيفة 3′ لصق الموقع16،17،18. التعبير عن المتغيرات E1A يتغير وفقا لفترة العدوى الغدية19،20.
لقد أظهرنا سابقا أن كلا من isoforms Nek4 تتفاعل مع عوامل الربط مثل SRSF1 وhnRNPA1 وعلى الرغم من isoform 2 التغييرات minigene E1A الربط البديل، isoform 1 ليس له أي تأثير في ذلك21. لأن isoform 1 هو isoform الأكثر وفرة ويغير مقاومة العلاج الكيميائي والاستجابة للتلف الحمض النووي، ونحن تقييم ما إذا كان يمكن تغيير الربط البديل E1A minigene في حالة الإجهاد.
الفحص مينيجين هو بسيط، منخفضة التكلفة وطريقة سريعة، لأنه يحتاج فقط استخراج الحمض النووي الريبي، توليف cDNA، تضخيم وجل agarose التحليلات، ويمكن أن يكون أداة مفيدة لتقييم منذ تأثير محتمل على الربط البديل من قبل بروتين المصالح حتى تأثير العلاجات المختلفة على نمط الربط البديل الخلوية.
Minigenes هي أدوات هامة لتحديد الآثار في الربط البديل العالمي في الجسم الحي. وقد استخدمت adenoviral minigene E1A بنجاح لعقود لتقييم دور البروتينات عن طريقزيادة كميةهذه في الخلية 13,14. هنا، نقترح استخدام E1A minigene لتقييم الربط البديل بعد التعرض للعلاج الكيميائي. تم استخدام خط …
The authors have nothing to disclose.
نشكر فونداساو دي أمبارو بيسكيسا دو استادو دي ساو باولو (FAPESP، من خلال غرانت تيماتيكو 2017/03489-1 إلى JK وزمالة إلى FLB 2018/05350-3) وConselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) لتمويل هذا البحث. نود أن نشكر الدكتور أدريان كراينر على توفير البلازميد pMTE1A وZerler وزملاؤه لعملهم في الاستنساخ E1A. كما نشكر البروفيسورة باتريسيا موريل، والأستاذة الدكتورة واندا بيريرا ألميدا، والبروفيسور الدكتور مارسيلو لانسيلوتي، والبروفيسورة الدكتورة كارينا كوغو كوغو مولر للسماح لنا باستخدام مساحة ومعدات مختبرهم.
100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
Agarose | Sigma | A9539-250G | |
Cisplatin | Sigma | P4394 | |
DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
Trypsin | Sigma | T4799 |