형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축.
Summary
이 방법은 형광 태그 sarcomere 단백질을 가진 다능한 줄기 세포 유래 심근세포를 사용하여 sarcomere 단축을 검사하는 것을 이용할 수 있습니다.
Abstract
다능성 줄기 세포 유래 심근세포(PSC-CM)는 배아 및 유도된 다능성 줄기(ES/iPS) 세포 모두에서 생성될 수 있다. 이 세포는 심장 질병 모델링을 위한 유망한 근원을 제공합니다. 심근병증의 경우, sarcomere 단축은 성인 심근세포와 함께 질병 표현형을 검사하는 표준 생리학적 평가 중 하나입니다. 그러나, 사용 가능한 방법은 PSC-CM의 수축도 평가하기에 적합하지 않습니다, 이러한 세포는 위상 대비 현미경 검사의 밑에 보이지 않는 저개발 사코메레스가 있기 때문에. 이 문제를 해결하고 PSC-CM을 사용하여 sarcomere 단축을 수행하기 위해 형광 태그 사코레 단백질및 형광 라이브 이미징이 사용되었습니다. 얇은 Z 라인과 M 라인은 각각 사마레의 양쪽 끝과 중앙에 있습니다. Z라인 단백질 -α-액티닌(ACTN2), 텔레토닌(TCAP), 액틴 관련 LIM 단백질(PDLIM3) 및 1개의 M라인 단백질—묘메신-2(Myom2) -는 형광 단백질로 태그하였다. 이러한 태그된 단백질은 내인성 대립구도에서 노크인또는 아데노 관련 바이러스(AAV)에서 발현될 수 있다. 여기서는 마우스와 인간 만능 줄기 세포를 심근세포로 분화하고, AAV를 생산하고, 라이브 이미징을 수행하고 분석하는 방법을 소개합니다. 또한 형광 태그 단백질로 sarcomere 단축의 분석을 용이하게 PSC-CM의 패턴 문화에 대한 폴리디메틸실록산 (PDMS) 우표를 생산하는 방법을 설명합니다. 사컴 단축을 평가하기 위해 박동 세포의 시간 경과 이미지는 전기 자극(0.5-1Hz)에서 높은 프레임레이트(초당 50-100 프레임)로 기록되었다. 셀 수축 과정에서 사코메 길이를 분석하기 위해, 기록된 타임랩스 이미지는 ImageJ/Fiji의 플러그인인 SarcOptiM을 적용하였다. 우리의 전략은 PSC-CM에서 심장 질환 표현형을 조사하기위한 간단한 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
심혈관 질환은 전 세계적으로 사망률의 주요원인이며 심근병증은 심장 관련 사망의 세 번째 원인을 나타낸다2. 심근병증은 심장 근육에 영향을 미치는 질병의 집단 그룹입니다. 유도 된 다능성 줄기 (iPS) 세포와 심근 세포 (PSC-CM)를 향한 iPS 세포의 지시 분화의 최근 개발은 심근병증의 체외 모델로 환자 게놈으로 심근세포를 연구하기위한 문을 열었습니다. 이들 세포는 심장 질환의 병리생리학을 이해하고, 분자 메커니즘을 해명하고, 다른 치료 후보3을테스트하는 데 사용될 수 있다. 이와 같이, 환자 유래 iPS 세포가 생성되었다(예를 들어, 비대성 심근병증 [HCM]4,5,부정맥 우심심근병증 [ARVC]6,확장된 심근병증 [DCM]7,및 미토콘드리아 관련 심근병증,미토콘드리아관련 심근병증이있다. 심근병증의 특성 중 하나는 sarcomeres의 기능 장애 및 중단이기 때문에, 상반신 기능을 균일하게 측정하는 유효한 도구가 필요합니다.
Sarcomere 단축은 동물 모델과 인간에서 파생 된 성인 심근 세포의 sarcomere 기능과 수축을 평가하는 가장 널리 사용되는 기술입니다. 사컴레 단축을 수행하려면 위상 대비하에서 보이는 잘 발달된 사카레가 필요합니다. 그러나, 시험관 내 디스플레이에서 배양된 PSC-CM은 저개발 및 무질서한 사코머를 나타내므로, 따라서, 사르코름단축(10)을제대로 측정하는 데 사용할 수 없다. PSC-CM의 수축성을 제대로 평가하는 이 어려움은 시험관 내심장 기능을 평가하는 플랫폼으로서의 사용을 방해합니다. PSC-CM 수축을 간접적으로 평가하기 위해, 원자력 현미경 검사법, 마이크로 포스트 어레이, 견인력 현미경 검사법 및 임피던스 측정은 이러한 세포가 주변 환경에 가해지는 모션의 효과를 측정하는 데 사용되어 왔다11,12,13. 실제 세포 운동의 보다 정교하고 덜 침습적인 비디오 현미경 기록(예를 들어, 소니로부터 SI8000)은 수축도 를 대안적으로 평가하는 데 사용될 수 있지만, 이 방법은 사르코메어 모션 또는 강제 생성운동학(14)을직접 측정하지 는 않는다.
PSC-CM에서 사코머 운동을 직접 측정하기 위해, 사코머 단백질에 형광 태깅과 같은 새로운 접근이 나타나고 있습니다. 예를 들어 Lifeact는 사마필모션(15,16)을측정하기 위해 필라멘트 액틴(F-actin)에 라벨을 붙이는 데사용된다. 유전자 변형 iPS 세포는 형광단백질17,18,19에의해 사코메르 단백질(예를 들어, α 액틴 [ACTN2] 및 Myomesin-2 [MYOM2])를 태깅하기 위한 또 다른 옵션이다.
이 논문에서는 Myom2-TagRFP(마우스 배아 줄기 [ES] 세포) 및 ACTN2-mCherry(인간 iPS 세포)를 사용하여 sarcomere 단축을 측정하기 위한 타임랩스 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 패턴 문화가 사마머 정렬을 용이하게한다는 것을 보여줍니다. 또한, 당사는 환자 유래 iPS 세포에 널리 적용될 수 있는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 사르메레 라벨링의 대체 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PSC-CM은 심장 질환을 모델링하고 약물의 효과를 테스트하기 위해 시험관 내 플랫폼으로 활용 될 수있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 그럼에도 불구하고 PSC-CM 기능을 평가하는 정확하고 통일된 방법을 먼저 수립해야 합니다. 대부분의 기능성 검사는 PSC-CM, 예를 들어 전기생리학, 칼슘 과도 및 신진대사(26)와함께 작동하며, 최초의 환자 유래 PSC-CM 연구 중 하나는 긴 QT 증후…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 토론및 기술 지원을 위해 지치 의과 대학의 재생 의학 부서의 모든 실험실 구성원을 인정하고 싶습니다. 이 연구는 의학 연구 개발 (AMED)에 대한 일본 기관의 보조금에 의해 지원되었다; JP18bm0704012 및 JP20bm0804018), 일본과학진흥협회(JSPS; JP19KK0219, 일본순환학회(기초연구보조금)
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
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