Accorciamento sarcomere dei cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali utilizzando proteine sarcomere con tag fluorescenti.
Summary
Questo metodo può essere utilizzato per esaminare l’accorciamento del sarcomero utilizzando cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali con proteine sarcomere con tag fluorescente.
Abstract
I cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali (PSC-CMs) possono essere prodotti sia da cellule staminali pluripotenti embrionali che indotte (ES/iPS). Queste cellule forniscono fonti promettenti per la modellazione delle malattie cardiache. Per le cardiomiopatie, l’accorciamento del sarcomero è una delle valutazioni fisiologiche standard che vengono utilizzate con cardiomiociti adulti per esaminare i loro fenotipi di malattia. Tuttavia, i metodi disponibili non sono appropriati per valutare la contrattilità dei PSC-CRM, in quanto queste cellule hanno sarcomer sottosviluppati che sono invisibili sotto microscopia a contrasto di fase. Per risolvere questo problema e per eseguire l’accorciamento del sarcomero con PSC-CMs, sono state utilizzate proteine sarcomere con tag fluorescenti e imaging vivo fluorescente. Le linee Z sottili e una linea M risiedono rispettivamente ad entrambe le estremità e al centro di un sarcomero. Le proteine della linea Z – α-actinin (ACTN2), telethonin (TCAP), e proteina LIM associata all’actina (PDLIM3) – e una proteina M-line – Miomesin-2 (Myom2) – sono state taggate con proteine fluorescenti. Queste proteine taggate possono essere espresse da alleli endogeni come knock-in o da virus adeno-associati (AAV). Qui introduciamo i metodi per differenziare le cellule staminali pluripotenti del topo e dell’uomo dai cardiomiociti, per produrre AAV e per eseguire e analizzare l’imaging dal vivo. Descriviamo anche i metodi per la produzione di francobolli in polidimetilsiloxano (PDMS) per una coltura modellata di PSC-CRM, che facilita l’analisi dell’accorciamento del sarcomero con proteine con tag fluorescenti. Per valutare l’accorciamento del sarcomero, le immagini time-lapse delle cellule che battono sono state registrate a un framerate elevato (50-100 fotogrammi al secondo) sotto stimolazione elettrica (0,5-1 Hz). Per analizzare la lunghezza del sarcomero nel corso della contrazione cellulare, le immagini time-lapse registrate sono state sottoposte a SarcOptiM, un plug-in per ImageJ /Fiji. La nostra strategia fornisce una semplice piattaforma per indagare i fenotipi di malattie cardiache nei PSC-CRM.
Introduction
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di mortalità intutto il mondo 1 e la cardiomiopatia rappresenta la terza causa di decessi cardiaci2. La cardiomiopatia è un gruppo collettivo di malattie che colpiscono i muscoli cardiaci. I recenti sviluppi delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) e la differenziazione diretta delle cellule iPS verso i cardiomiociti (PSC-CMs) hanno aperto la porta allo studio dei cardiomiociti con il genoma del paziente come modello in vitro di cardiomiopatia. Queste cellule possono essere utilizzate per comprendere la fisiopatologia delle malattie cardiache, per chiarire i loro meccanismi molecolari e per testare diversi candidati terapeutici3. C’è un enorme interesse, quindi sono state generate cellule iPS derivate dal paziente (ad esempio, cardiomiopatia ipertrofica [HCM]4,5, cardiomiopatia ventricolare destra aritmogena [ARVC]6, cardiomiopatia dilatata [DCM]7e cardiomiopatie mitocondrialicorrelate 8,9). Poiché una delle caratteristiche della cardiomiopatia è la disfunzione e l’interruzione dei sarcomeri, è necessario uno strumento valido che misura uniformemente la funzione sarcomere.
L’accorciamento del sarcomero è la tecnica più utilizzata per valutare la funzione del sarcomero e la contrattilità dei cardiomiociti adulti derivati da modelli animali e umani. Per eseguire l’accorciamento del sarcomero, sono necessari sarcomer ben sviluppati visibili sotto il contrasto di fase. Tuttavia, i PSC-PM coltivati in vitro mostrano sarcomeres sottosviluppati e disorganizzati e, pertanto, non possono essere utilizzati per misurare correttamente l’accorciamento del sarcomero10. Questa difficoltà di valutare correttamente la contrattilità dei PSC-CRM ne ostacola l’utilizzo come piattaforma per valutare le funzioni cardiache in vitro. Per valutare indirettamente la contrattilità PSC-CMs, sono state utilizzate microscopie a forza atomica, array di micro-post, microscopia a forza di trazione e misurazioni dell’impedenza per misurare gli effetti del movimento esercitato da queste cellulesull’ambiente circostante 11,12,13. Registrazioni video-microscopie più sofisticate e meno invasive del moto cellulare effettivo (ad esempio, SI8000 di SONY) possono essere utilizzate per valutare in alternativa la loro contrattilità, tuttavia, questo metodo non misura direttamente il movimento del sarcomero o la cinetica di generazione di forza14.
Per misurare direttamente il movimento del sarcomero nei PSC-CRM, stanno emergendo nuovi approcci, come il tagging fluorescente alle proteine sarcomere. Ad esempio, Lifeact viene utilizzato per etichettare l’actina filamentosa (F-actin) per misurare il movimento del sarcomero15,16. Le cellule iPS geneticamente modificate sono un’altra opzione per etichettare le proteine del sarcomero (ad esempio, α-actina [ACTN2] e Miomesina-2 [MYOM2]) dalla proteina fluorescente17,18,19.
In questo documento, descriviamo come eseguire l’imaging time-lapse per misurare l’accorciamento del sarcomero utilizzando Myom2-TagRFP (cellule staminali embrionali di topo [ES]) e ACTN2-mCherry (cellule iPS umane). Mostriamo anche che una cultura modellata facilita l’allineamento dei sarcomei. Inoltre, descriviamo un metodo alternativo di etichettatura dei sarcomei, utilizzando virus associati ad adeno (AAV), che possono essere ampiamente applicati alle cellule iPS derivate dal paziente.
Protocol
Representative Results
Discussion
I PSC-CRM hanno un grande potenziale per essere utilizzati come piattaforma in vitro per modellare le malattie cardiache e testare gli effetti dei farmaci. Tuttavia, è necessario prima stabilire un metodo accurato e unificato per valutare le funzioni PSC-CMs. La maggior parte dei test funzionali funziona con PSC-MC, ad esempio elettrofisiologia, transitore di calcio e metabolismo26,e uno dei primi studi PSC-CM derivati dal paziente riguardava la sindrome del QT lungo27<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare tutti i membri del laboratorio della Divisione di Medicina Rigenerativa dell’Università medica di Jichi per l’utile discussione e assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell’Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (AMED; JP18bm0704012 e JP20bm0804018), la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), e la Japanese Circulation Society (la Grant for Basic Research) a H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
- Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
- Cho, G. -. S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
- Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
- Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
- Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
- Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
- Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
- Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
- Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
- Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. , (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
- Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).
