פרוטוקול זה מציג מודל ניסיוני חדשני של תרבות איברי שור פרו-פלמטורית ומנוונת כדי לדמות ניוון דיסק בין חולייתי בשלב מוקדם.
ניוון דיסק בין חולייתי סימפטומטי (IVD) (IDD) הוא נטל חברתי-כלכלי גדול ומאופיין בדלקת והשפלת רקמות. בשל היעדר טיפולים סיבתיים, יש צורך דחוף במודלים חדשניים של תרבות איברים ניסיונית כדי לחקור את המנגנונים המעורבים בהתקדמות המחלה, למצוא מטרות טיפוליות ולהפחית את הצורך במודלים של בעלי חיים. אנו מציגים כאן פרוטוקול מודל תרבות איברים תלת מימדי חדשני המחקה את המיקרו-ווירון הפרו-פלמטורי והקטבולי, שקיים במהלך IDD.
בתחילה, עירויים של שור נותחו, נוקו ותרביתו במדיום תרבית הרקמות. טעינה פיזיולוגית או פתולוגית דינמית הוחלה בביוריאקטור בהתאמה אישית במשך שעתיים ביום. IVDs הוקצו לקבוצת ביקורת (מדיום גלוקוז גבוה, טעינה פיזיולוגית, הזרקת מלח אגירה פוספט) וקבוצה פתולוגית (בינוני גלוקוז נמוך, טעינה פתולוגית, נמק הגידול גורם אלפא הזרקה) במשך ארבעה ימים. ניתוח ביטוי גנים מתאי פולפוסוס גרעין שנאספו של IVDs ואנליזה אימונוסורבנטית הקשורה לאנזימים של מדיית תרבות האיברים הממוזגת בוצעה.
הנתונים שלנו חשפו ביטוי גבוה יותר של סמנים דלקתיים וגובה דיסק מופחת לאחר טעינה בקבוצה הפתולוגית בהשוואה לקבוצת הביקורת. פרוטוקול זה אמין כדי לדמות דלקת IVD ניוון והוא יכול להיות מורחב עוד יותר כדי להרחיב את היקף היישום שלה.
כאבי גב תחתון (LBP) יכולים להשפיע על אנשים בכל הגילאים והוא גורם מוביל לנכות ברחבי העולם1,2,3. העלות הכוללת המשויכת LBP עולה $100 מיליארד דולר בשנה4,5. ניוון דיסק בין חולייתי סימפטומטי (IVD) (IDD), מצב המאופיין בדלקת והשפלת רקמות, הוא הגורם העיקרי של LBP6,7. באופן ספציפי, IDD מאופיין על ידי פירוק מתפתח בהדרגה של המטריצה החוץ תאית של IVD (ECM), המושרה ומופעל על ידי גורמים מרובים שמובילים פתולוגיה מואצת, הפרעות נוירולוגיות, ובסופו של דבר נכות. יתר על כן, IDD קשורה לשחרור ציטוקינים proinflammatory, ביומכניקה בעמוד השדרה שונה, אנגיוגנזה, ו ingrowth עצבי, אשר מגביר את תחושת הכאב, בסך הכל גורם LBP כרונית (דיסקופתיה פעילה)6,8. עד כה, אפשרויות הטיפול כוללות כריתת דיסק והיתוך עוקב של החוליות הסמוכות, השתלת תותבת IVD, או גישות לא כירורגיות, כגון תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידים, אופיואידים, ומרפי שרירים לחולים עם IDD9. שתי האפשרויות הטיפוליות הסטנדרטיות הנוכחיות, כירורגיות ולא כירורגיות, יעילות רק בחלקן ולא מצליחות לטפל בבעיה הביולוגית הבסיסית9,10. מחלת דיסק ניוונית בשלב מוקדם מאופיינת בתגובת רקמה דלקתית ראשונית, במיוחד עלייה בביטוי נמק נמק-אלפא גידולי (TNF-alpha)11. שינויים אלה בדיסק מוקדם מתרחשים בעיקר ברמה התאית מבלי לשבש את ארכיטקטורת הדיסק, בעבר יכול להיות חיקוי על ידי מחסור תזונתי בתנאים פרו דלקתיים12. לכן, סימולציה מדויקת של מצב in vivo לחקור מנגנוני ניוון אלה ולמצוא מטרות טיפוליות מתאימות היא קריטית. בנוסף, לסימולציות אלה של תכונות מולקולריות, סביבת הטעינה המכנית של הדיסקים ממלאת תפקיד מפתח בשינויים פתולוגיים ופיזיולוגיים של IVD. כתוצאה מכך, שילוב גישות אלה יביא אותנו צעד אחד קדימה כדי לחקות את microenvironment מורכב של IVD ב vivo. כיום אין מחקרים בהתחשב בהיבט של טעינה דינמית יחד עם ההגדרה הפרו דלקתית והתזונתית למיטב ידיעתנו.
למרות מודלים בעלי חיים גדולים לאפשר את החקירה של פוטנציאל רלוונטי אינטראקציות vivo, הם יקרים ועבודה אינטנסיבית. יתר על כן, כמו השימוש במודלים בעלי חיים במחקר כבר זמן רב עניין של מחלוקת, צמצום מספר בעלי החיים הדרושים כדי לענות על שאלות מחקר חשובות הוא עניין רב. לבסוף, אין כיום מודל חיה אידיאלי לחקות IDD במחקר IVD13,14. לכן, יש צורך להקים תחליף חסכוני ואמין, כגון מודל תרבות איברים כדי לדמות IDD ותהליכים דלקתיים וניוון הקשורים. לאחרונה, היישום של הפרוטוקול הנוכחי על הקמת מודל תרבות איברים proinflammatory ניווני כדי לדמות מחלת דיסק בין חולייתי בשלב מוקדם אפשר לנו לחקור את ההשפעה של תרופות אנטי דלקתיות בתרבות איברים IDD15.
כאן, אנו מתארים כיצד להשיג דיסקים בין חולייתיים שור לגרום למצב של IDD בשלב מוקדם באמצעות microenvironment קטבולי proinflammatory הנגרמת על ידי הזרקה תוך-דיסקית ישירה של נמק הגידול גורם אלפא (TNF-α) וטעינה ניוונית ב bioreactor בתנאים בינוניים מזינים נמוכים. איור 1 ממחיש את המודל הניסיוני ומציג את הביוריאקטור המשמש להדמיית תנאי טעינה ניווניים ופיזיולוגיים.
איור 1: איור של ההתקנה הניסיונית. A: זנב שור; B: דיסקים בין חולייתיים של שור מנותח; C: העברת הדיסק לצלחת היטב עם מדיום תרבות; D: טעינת הסימולציה בביוריאקטור; E: טכניקת הזרקה תוך-דיסקית; F: IVD לאחר הזרקה של צבע כחול PBS / trypan כדי לחשוף את ההפצה. IDD: ניוון דיסק בין חולייתי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סיפקנו כאן פרוטוקול מפורט כדי לדמות IVDD ניווני ודלקתי. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם עבור בדיקות מפורטות של מסלולים דלקתיים המובילים להשפעות ההרסניות על הדיסק. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לעזור לקבוע מטרות טיפוליות מבטיחות המעורבות בהתקדמות המחלה.
לאחרונה הראינו כי TNF-α רקומבי…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרן AO ו- AOSpine הבינלאומי. באבאק סראבי זכה לתמיכת מלגות מקרן עמוד השדרה הגרמנית וקרן דלקת מפרקים ניוונית גרמנית. גרנוט לאנג נתמך על ידי תוכנית ברטה-אוטנשטיין למדענים קליניים מתקדמים, הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת פרייבורג, גרמניה.
1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |