Dit protocol schetst een routinemethode voor het gebruik van seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie (SBF-SEM), een krachtige 3D-beeldvormingstechniek. Succesvolle toepassing van SBF-SEM hangt af van de juiste fixatie- en weefselkleuringstechnieken, evenals zorgvuldige overweging van beeldvormingsinstellingen. Dit protocol bevat praktische overwegingen voor het gehele proces.
Serial block-face scanning electron microscopie (SBF-SEM) maakt het mogelijk om honderden tot duizenden serieel geregistreerde ultrastructurele beelden te verzamelen, wat een ongekend driedimensionaal beeld biedt van weefselmicroanatomie. Hoewel SBF-SEM de afgelopen jaren een exponentiële toename van het gebruik heeft gezien, zijn technische aspecten zoals een goede weefselvoorbereiding en beeldvormingsparameters van het grootste belang voor het succes van deze beeldvormingsmodaliteit. Dit beeldvormingssysteem profiteert van het geautomatiseerde karakter van het apparaat, waardoor men de microscoop onbeheerd kan achterlaten tijdens het beeldvormingsproces, met de geautomatiseerde verzameling van honderden beelden mogelijk op één dag. Zonder de juiste weefselvoorbereiding kan de cellulaire ultrastructuur echter zodanig worden gewijzigd dat onjuiste of misleidende conclusies kunnen worden getrokken. Bovendien worden afbeeldingen gegenereerd door het blokvlak van een met hars ingebed biologisch monster te scannen en dit brengt vaak uitdagingen en overwegingen met zich mee die moeten worden aangepakt. De accumulatie van elektronen in het blok tijdens beeldvorming, bekend als “weefsel opladen”, kan leiden tot een verlies van contrast en een onvermogen om cellulaire structuur te waarderen. Bovendien kan het verhogen van de intensiteit/spanning van elektronenbundels of het verlagen van de stralingsscansnelheid de beeldresolutie verhogen, maar dit kan ook de ongelukkige bijwerking hebben van het beschadigen van het harsblok en het vervormen van latere beelden in de beeldvormingsreeks. Hier presenteren we een routineprotocol voor de voorbereiding van biologische weefselmonsters die cellulaire ultrastructuur behouden en het opladen van weefsel verminderen. We bieden ook beeldvormingsoverwegingen voor de snelle verwerving van hoogwaardige seriële beelden met minimale schade aan het weefselblok.
Serial block face scanning electron microscopie (SBF-SEM) werd voor het eerst beschreven door Leighton in 1981, waar hij een scanning elektronenmicroscoop maakte, aangevuld met een ingebouwde microtome die dunne delen weefsel ingebed in hars kon snijden en in beeld kon snijden. Helaas beperkten technische beperkingen het gebruik ervan tot geleidende monsters, omdat niet-geleidende monsters zoals biologisch weefsel onaanvaardbare oplaadniveaus (elektronenopbouw in het weefselmonster)1. Terwijl het coaten van de blokwand tussen sneden met verdampte koolstof verminderde weefsel opladen, deze sterk verhoogde beeldverwervingstijd en beeldopslag bleef een probleem omdat computertechnologie op dat moment onvoldoende was om de grote bestandsgroottes die door het apparaat werden gecreëerd te beheren. Deze methodiek is in 2004 door Denk en Horstmann opnieuw bekeken met behulp van een SBF-SEM uitgerust met een variabele drukkamer2. Dit maakte de introductie van waterdamp in de beeldvormingskamer mogelijk, waardoor het opladen in het monster werd beperkt, waardoor beeldvorming van niet-geleidende monsters levensvatbaar werd, zij het met verlies van beeldresolutie. Verdere verbeteringen in weefselvoorbereidings – en beeldvormingsmethoden maken het nu mogelijk om beeldvorming met behulp van hoog vacuüm mogelijk te maken, en SBF-SEM-beeldvorming is niet langer afhankelijk van waterdamp om het opladen3,4,5,6,7,8,9af te voeren . Hoewel SBF-SEM de afgelopen jaren een exponentiële toename van het gebruik heeft gezien, zijn technische aspecten zoals een goede weefselvoorbereiding en beeldvormingsparameters van het grootste belang voor het succes van deze beeldvormingsmodaliteit.
SBF-SEM maakt de geautomatiseerde verzameling van duizenden serieel geregistreerde elektronenmicroscopiebeelden mogelijk, met een planaire resolutie van 3-5 nm10,11. Weefsel, geïmpregneerd met zware metalen en ingebed in hars, wordt geplaatst in een scanning elektronenmicroscoop (SEM) met een ultramicrotome uitgerust met een diamantmes. Een vlak oppervlak wordt gesneden met het diamantmes, het mes wordt ingetrokken en het oppervlak van het blok wordt gescand in een rasterpatroon met een elektronenstraal om een beeld van weefsel ultrastructuur te creëren. Het blok wordt vervolgens een bepaalde hoeveelheid (bijv. 100 nm) in de z-as verhoogd, bekend als een “z-stap”, en een nieuw oppervlak wordt gesneden voordat het proces wordt herhaald. Op deze manier wordt een 3-dimensionaal (3D) blok beelden geproduceerd terwijl het weefsel wordt weggesneden. Dit beeldvormingssysteem profiteert verder van het geautomatiseerde karakter van het apparaat, waardoor men de microscoop onbeheerd kan achterlaten tijdens het beeldvormingsproces, met de geautomatiseerde verzameling van honderden beelden mogelijk op één dag.
Terwijl SBF-SEM-beeldvorming voornamelijk backscattered elektronen gebruikt om een beeld van het blokvlak te vormen, worden secundaire elektronen gegenereerd tijdens het beeldvormingsproces12. Secundaire elektronen kunnen zich ophopen, naast backscattered en primaire-bundel elektronen die niet ontsnappen aan het blok, en produceren “weefsel opladen,” die kan leiden tot een gelokaliseerd elektrostatisch veld aan de block-face. Deze elektronenaccumulatie kan het beeld vervormen of ervoor zorgen dat elektronen uit het blok worden geworpen en bijdragen aan het signaal dat door de backscatterdetector wordt verzameld, waardoor de signaal-ruisverhouding wordt verlaagd13. Hoewel het niveau van weefsellading kan worden verlaagd door de spanning of intensiteit van de elektronenbundel te verminderen of de verblijftijd van de bundel te verkorten, resulteert dit in een verminderde signaal-ruisverhouding14. Wanneer een elektronenbundel met een lagere spanning of intensiteit wordt gebruikt, of de bundel slechts gedurende een kortere periode in elke pixelruimte mag blijven hangen, worden minder teruggetrokken elektronen uit het weefsel geworpen en door de elektronendetector opgevangen, wat resulteert in een zwakker signaal. Denk en Horstmann hebben dit probleem aangepakt door waterdamp in de kamer te brengen, waardoor de lading in de kamer en op het blokgezicht wordt verminderd ten koste van de beeldresolutie. Bij een kamerdruk van 10-100 Pa wordt een deel van de elektronenbundel verspreid, wat bijdraagt aan beeldruis en een verlies van resolutie, maar dit produceert ook ionen in de monsterkamer die de lading binnen het monsterblok neutraliseren2. Recentere methoden voor het neutraliseren van lading binnen het monsterblok gebruiken focale gasinjectie van stikstof over het blokvlak tijdens beeldvorming, of het introduceren van negatieve spanning in het SBF-SEM-stadium om de energie van de sondestraallading te verminderen en het verzamelde signaal te verhogen6,7,15. In plaats van stadiumbias, kamerdruk of gelokaliseerde stikstofinjectie te introduceren om de ladingsopbouw op het blokoppervlak te verminderen, is het ook mogelijk om de geleidbaarheid van de hars te verhogen door koolstof in de harsmix te introduceren, waardoor agressievere beeldvormingsinstellingen mogelijk zijn16. Het volgende algemene protocol is een aanpassing van het in 2010 gepubliceerde Deerinck et al.-protocol en omvat wijzigingen in weefselvoorbereidings – en beeldvormingsmethoden die we nuttig vonden voor het minimaliseren van weefselladen met behoud van beeldverwerving met hoge resolutie3,17,18,19. Hoewel het eerder genoemde protocol gericht was op weefselverwerking en impregneren van zware metalen, biedt dit protocol inzicht in de beeldvormings-, gegevensanalyse- en reconstructieworkflow die inherent is aan SBF-SEM-studies. In ons laboratorium, dit protocol is met succes en reproduceerbaar toegepast op een breed scala van weefsels, waaronder hoornvlies en voorste segment structuren, ooglid, traan en harderian klier, netvlies en oogzenuw, hart, long en luchtwegen, nier, lever, cremaster spier, en cerebrale cortex / medulla, en in een verscheidenheid van soorten, waaronder muis, rat, konijn, cavia, vis, monolayer en gelaagde celculturen, varken, niet-menselijke primaat, evenals mens2. Hoewel kleine veranderingen de moeite waard kunnen zijn voor specifieke weefsels en toepassingen, is dit algemene protocol zeer reproduceerbaar en nuttig gebleken in de context van onze kernbeeldvormingsfaciliteit.
Het doel van dit methodedocument is om de weefselvoorbereidings- en beeldvormingsmethodologie te benadrukken die ons lab in staat heeft gesteld om op betrouwbare wijze seriële elektronenmicroscopiebeelden met hoge resolutie vast te leggen, en om te wijzen op kritieke stappen die tot dit resultaat leiden, evenals mogelijke valkuilen die kunnen optreden bij het uitvoeren van SBF-SEM-beeldvorming. Succes met behulp van dit protocol vereist een goede fixatie van weefsel, impregnatie van zware metalen in het monster, wijzigi…
The authors have nothing to disclose.
We willen Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown en Margaret Gondo bedanken voor hun uitstekende technische assistentie. Dit onderzoek werd deels ondersteund door National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 en P30 EY007551 (National Eye Institute), deels door de Lion’s Foundation for Sight, en deels door NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health &Human Development).
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets | Industrial Rivet & Fastener Co. | 6N37RFLAP/1100 | Used as specimen pins. |
2.5mm Flathead Screwdriver | Wiha Quality Tools | 27225 | |
Acetone | Electron Microscopy Sciences | RT 10000 | Used to dilute silver paint. |
Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A8949 | |
Calcium Chloride | FisherScientific | C79-500 | |
Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | |
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target | Denton Vacuum | N/A | This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable. |
Double-edged Razors | Fisher Scientific | 50-949-411 | |
Embed 812 | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM | Gatan & Tescan | N/A | This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable. |
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) | Electron Microscopy Sciences | 72630-05 | |
Gluteraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
Gorilla Super Glue – Impact Tough | NA | NA | Refered to as cyanoacrylate glue in text. |
Ketjen Black | HM Royal | EC-600JD | Refered to as carbon black in text. |
KOH | FisherScientific | 18-605-593 | |
Lead Nitrate | Fisher Scientific | L62-100 | |
Microwave | Pelco | BioWave Pro | This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable. |
Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 201030 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
Silicone Embedding Mold | Ted Pella | 10504 | |
Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Samco Transfer Pipette | ThermoFisher Scientific | 202 | Used to make specimen pin storage tubes. |
Swiss Pattern Needle Files | Electron Microscopy Sciences | 62115 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Uranyl Acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 | |
Reconstruction Software | |||
Amira Software | Thermo Scientific | N/A | Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9. |
Fiji (Fiji is Just ImageJ) | ImageJ.net | N/A | TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation. |
Microscopy Image Browser (MIB) | University of Helsinki, Institute of Biotechnology | N/A | |
Reconstuct Software | Neural Systems Lab | N/A | |
SuRVoS Workbench | Diamond Light Source & The University of Nottingham | N/A | |
SyGlass | IstoVisio, Inc. | N/A | Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods. |