يحدد هذا البروتوكول طريقة روتينية لاستخدام المجهر الإلكتروني للمسح التسلسلي لوجه الكتلة (SBF-SEM)، وهي تقنية تصوير ثلاثية الأبعاد قوية. يعتمد التطبيق الناجح ل SBF-SEM على تقنيات التثبيت وتلطيخ الأنسجة المناسبة ، بالإضافة إلى النظر بعناية في إعدادات التصوير. ويتضمن هذا البروتوكول اعتبارات عملية لهذه العملية برمتها.
يسمح المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) بجمع مئات إلى آلاف الصور فائقة الهيكلة المسجلة بشكل متسلسل ، مما يوفر رؤية ثلاثية الأبعاد غير مسبوقة لاستئصال الأنسجة الدقيقة. في حين شهدت SBF-SEM زيادة هائلة في الاستخدام في السنوات الأخيرة ، فإن الجوانب التقنية مثل إعداد الأنسجة السليمة ومعلمات التصوير لها أهمية قصوى لنجاح طريقة التصوير هذه. يستفيد نظام التصوير هذا من الطبيعة الآلية للجهاز ، مما يسمح للمرء بترك المجهر دون مراقبة أثناء عملية التصوير ، مع إمكانية جمع مئات الصور تلقائيا في يوم واحد. ومع ذلك، دون إعداد الأنسجة المناسبة البنية الفوقية الخلوية يمكن تغييرها بطريقة يمكن استخلاص استنتاجات غير صحيحة أو مضللة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء الصور عن طريق مسح الوجه الكتلي لعينة بيولوجية مضمنة في الراتنج، وهذا غالبا ما يمثل تحديات واعتبارات يجب معالجتها. تراكم الإلكترونات داخل الكتلة أثناء التصوير، والمعروفة باسم “شحن الأنسجة”، يمكن أن يؤدي إلى فقدان التباين وعدم القدرة على تقدير الهيكل الخلوي. وعلاوة على ذلك، في حين أن زيادة كثافة شعاع الإلكترون / الجهد أو خفض سرعة مسح شعاع يمكن أن تزيد من دقة الصورة، وهذا يمكن أن يكون أيضا الآثار الجانبية المؤسفة من إتلاف كتلة الراتنج وتشويه الصور اللاحقة في سلسلة التصوير. هنا نقدم بروتوكول روتيني لإعداد عينات الأنسجة البيولوجية التي تحافظ على البنية الفوقية الخلوية ويقلل من شحن الأنسجة. كما نقدم اعتبارات التصوير للحصول السريع على صور تسلسلية عالية الجودة مع الحد الأدنى من الضرر لكتلة الأنسجة.
تم وصف المجهر الإلكتروني (SBF-SEM) لأول مرة من قبل Leighton في عام 1981 حيث صمم مجهرا إلكترون المسح الضوئي معززا بفغر صغير مدمج يمكن أن يقطع ويصور أقساما رقيقة من الأنسجة المضمنة في الراتنج. لسوء الحظ، القيود التقنية حصرت استخدامه في العينات التوصيلية، حيث تراكمت عينات غير موصلة مثل الأنسجة البيولوجية مستويات غير مقبولة من الشحن (تراكم الإلكترون داخل عينة الأنسجة)1. في حين طلاء كتلة الوجه بين التخفيضات مع الكربون المتبخر خفض شحن الأنسجة، وهذا الوقت زيادة كبيرة في اقتناء التصوير وتخزين الصور ظلت مشكلة كما تكنولوجيا الكمبيوتر في ذلك الوقت لم تكن كافية لإدارة أحجام الملفات الكبيرة التي أنشأها الجهاز. تمت إعادة النظر في هذه المنهجية من قبل دنك وهورستمان في عام 2004 باستخدام SBF-SEM مجهزة بغرفة ضغطمتغيرة 2. وقد سمح ذلك بإدخال بخار الماء إلى غرفة التصوير مما يقلل من الشحن داخل العينة ، مما يجعل تصوير العينات غير التوصيلية قابلا للتطبيق وإن كان مع فقدان دقة الصورة. مزيد من التحسينات في إعداد الأنسجة وطرق التصوير تسمح الآن للتصوير باستخدام فراغ عالية، والتصوير SBF-SEM لم يعد يعتمد على بخار الماء لتبديل الشحن3،4،5،6،7،8،9. في حين شهدت SBF-SEM زيادة هائلة في الاستخدام في السنوات الأخيرة ، فإن الجوانب التقنية مثل إعداد الأنسجة السليمة ومعلمات التصوير لها أهمية قصوى لنجاح طريقة التصوير هذه.
SBF-SEM يسمح لجمع الآلي من الآلاف من الصور المجهر الإلكتروني المسجلة تسلسليا، مع قرار مستو صغيرة مثل 3-5 نانومتر10،11. يتم وضع الأنسجة، المشربة بالمعادن الثقيلة والمضمنة في الراتنج، داخل المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) التي تحتوي على بروتين فائق مزود بسكين الماس. يتم قطع سطح مستو بسكين الماس ، ويتم سحب السكين ، ويتم مسح سطح الكتلة في نمط النقطية مع شعاع الإلكترون لإنشاء صورة للبنية فوقية الأنسجة. ثم يتم رفع الكتلة كمية محددة (على سبيل المثال، 100 نانومتر) في المحور z، والمعروفة باسم “خطوة z”، ويتم قطع سطح جديد قبل تكرار العملية. وبهذه الطريقة يتم إنتاج كتلة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من الصور أثناء قطع الأنسجة. يستفيد نظام التصوير هذا بشكل أكبر من الطبيعة الآلية للجهاز ، مما يسمح للمرء بترك المجهر دون مراقبة أثناء عملية التصوير ، مع إمكانية جمع مئات الصور تلقائيا في يوم واحد.
في حين أن التصوير SBF-SEM يستخدم في المقام الأول الإلكترونات المكثرة لتشكيل صورة لوجه الكتلة ، يتم إنشاء الإلكترونات الثانوية أثناء عملية التصوير12. يمكن أن تتراكم الإلكترونات الثانوية ، إلى جانب الإلكترونات المكبتة والحزمة الأولية التي لا تفلت من الكتلة ، وتنتج “شحن الأنسجة” ، مما يمكن أن يؤدي إلى حقل كهربائي محلي في وجه الكتلة. يمكن أن يشوه تراكم الإلكترون هذا الصورة أو يتسبب في إخراج الإلكترونات من الكتلة والمساهمة في الإشارة التي يجمعها كاشف الرواصد الخلفي ، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء13. في حين يمكن خفض مستوى شحن الأنسجة عن طريق تقليل الجهد شعاع الإلكترون أو كثافة، أو تقليل وقت الإسهاب شعاع، وهذا يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء14. عندما يتم استخدام شعاع إلكترون من الجهد المنخفض أو الكثافة ، أو يسمح للشعاع فقط بالسكن داخل كل مساحة بكسل لفترة أقصر من الزمن ، يتم إخراج الإلكترونات الأقل تشتتا من الأنسجة والتقاطها بواسطة كاشف الإلكترونات مما يؤدي إلى إشارة أضعف. تعامل دنك وهورستمان مع هذه المشكلة من خلال إدخال بخار الماء إلى الغرفة ، وبالتالي تقليل الشحن في الغرفة وعلى وجه الكتلة على حساب دقة الصورة. مع ضغط غرفة من 10-100 السلطة الفلسطينية، وتناثر جزء من شعاع الإلكترون المساهمة في ضوضاء الصورة وفقدان الدقة، ولكن هذا ينتج أيضا أيونات في غرفة العينة التي تحييد تهمة داخل كتلة العينة2. أساليب أكثر حداثة لتحييد تهمة داخل كتلة عينة استخدام حقن الغاز البؤري من النيتروجين على كتلة الوجه أثناء التصوير، أو إدخال الجهد السلبي إلى مرحلة SBF-SEM لتقليل طاقة المسبار شعاع الشحن وزيادةإشارةجمعت 6،7،15. بدلا من إدخال التحيز المرحلة، ضغط الغرفة أو حقن النيتروجين المترجمة لتقليل تراكم تهمة على سطح الكتلة، فمن الممكن أيضا لزيادة الموصلية من الراتنج عن طريق إدخال الكربون إلى مزيج الراتنج السماح لإعدادات التصوير أكثر عدوانية16. البروتوكول العام التالي هو تكييف لبروتوكول Deerinck et al. الذي نشر في عام 2010 ويغطي التعديلات على منهجيات إعداد الأنسجة والتصوير التي وجدناها مفيدة لتقليل شحن الأنسجة مع الحفاظ على اكتساب صورة عالية الدقة3و17و18و19. في حين أن البروتوكول المذكور سابقا ركز على معالجة الأنسجة وتلقيح المعادن الثقيلة ، يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة في سير عمل التصوير وتحليل البيانات وإعادة الإعمار المتأصل في دراسات SBF-SEM. في مختبرنا، تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح واستنساخ على مجموعة واسعة من الأنسجة بما في ذلك القرنية وهياكل الجزء الأمامي، الجفن، الغدة الكظرية والأصعب، شبكية العين والعصب البصري، القلب، الرئة والمجرى الهوائي، الكلى، الكبد، عضلة كريماستر، والقشرة الدماغية / النخاع، وفي مجموعة متنوعة من الأنواع بما في ذلك الماوس، الفئران، الأرانب، خنزير غينيا، الأسماك، أحادي الطبقة وثقافات الخلايا الطبقية، الخنزير، الرئيسيات غير البشرية، وكذلك الإنسان20،21،22،23. في حين أن التغييرات الصغيرة قد تكون جديرة بالاهتمام بالنسبة لأنسجة وتطبيقات محددة ، فقد أثبت هذا البروتوكول العام أنه قابل للاستنساخ ومفيد للغاية في سياق منشأة التصوير الأساسية لدينا.
الغرض من ورقة الأساليب هذه هو تسليط الضوء على منهجية إعداد الأنسجة والتصوير التي سمحت لمختبرنا بالتقاط صور المجهر الإلكتروني التسلسلي عالية الدقة بشكل موثوق ، والإشارة إلى الخطوات الحاسمة التي تؤدي إلى هذه النتيجة وكذلك المزالق المحتملة التي يمكن أن تحدث عند إجراء التصوير SBF-SEM. النجاح ب?…
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر الدكتور سام هانلون وإيفلين براون ومارغريت غوندو على مساعدتهم التقنية الممتازة. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 EY-018239 و P30 EY007551 (المعهد الوطني للعيون) ، جزئيا من قبل مؤسسة الأسد للبصر ، وجزؤا من قبل NIH 1R15 HD084262-01 (المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية).
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets | Industrial Rivet & Fastener Co. | 6N37RFLAP/1100 | Used as specimen pins. |
2.5mm Flathead Screwdriver | Wiha Quality Tools | 27225 | |
Acetone | Electron Microscopy Sciences | RT 10000 | Used to dilute silver paint. |
Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A8949 | |
Calcium Chloride | FisherScientific | C79-500 | |
Conductive Silver Paint | Ted Pella | 16062 | |
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target | Denton Vacuum | N/A | This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable. |
Double-edged Razors | Fisher Scientific | 50-949-411 | |
Embed 812 | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM | Gatan & Tescan | N/A | This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable. |
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) | Electron Microscopy Sciences | 72630-05 | |
Gluteraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
Gorilla Super Glue – Impact Tough | NA | NA | Refered to as cyanoacrylate glue in text. |
Ketjen Black | HM Royal | EC-600JD | Refered to as carbon black in text. |
KOH | FisherScientific | 18-605-593 | |
Lead Nitrate | Fisher Scientific | L62-100 | |
Microwave | Pelco | BioWave Pro | This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable. |
Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 201030 | |
Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
Silicone Embedding Mold | Ted Pella | 10504 | |
Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Samco Transfer Pipette | ThermoFisher Scientific | 202 | Used to make specimen pin storage tubes. |
Swiss Pattern Needle Files | Electron Microscopy Sciences | 62115 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Uranyl Acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 | |
Reconstruction Software | |||
Amira Software | Thermo Scientific | N/A | Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9. |
Fiji (Fiji is Just ImageJ) | ImageJ.net | N/A | TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation. |
Microscopy Image Browser (MIB) | University of Helsinki, Institute of Biotechnology | N/A | |
Reconstuct Software | Neural Systems Lab | N/A | |
SuRVoS Workbench | Diamond Light Source & The University of Nottingham | N/A | |
SyGlass | IstoVisio, Inc. | N/A | Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods. |