JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Mikrofizyolojik Sistem Kullanarak İnsan Meme Dokusunda Meme Kanseri Modellemesi

Published: April 23, 2021
doi:
10.3791/62009
, , , , , ,
1Department of Surgery,Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation,Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering,Louisiana State University, 5Department of Medicine,Tulane University School of Medicine

Summary

Bu protokol, raf malzemeleri ile birincil insan meme dokusu kullanılarak meme kanserini incelemek için bir in vitro mikrofizyolojik sistemin inşasını açıklar.

Abstract

Meme kanseri (M.Ö. ) kadınlar için önde gelen ölüm nedeni olmaya devam etmektedir. Bc araştırmalarına yılda 700 milyon dolardan fazla yatırım olmasına rağmen, aday BC ilaçlarının% 97’si klinik çalışmalarda başarısız oluyor. Bu nedenle, hastalığı anlamamızı geliştirmek için yeni modellere ihtiyaç vardır. NIH Mikrofizyolojik Sistemler (MPS) programı, temel bilim keşiflerinin klinik çevirisini geliştirmek ve yeni terapötik stratejiler vaat etmek için geliştirilmiştir. Burada meme kanserleri için MPS (BC-MPS) üretmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu model, adipoz türevli kök hücre sayfaları (ASC) arasında WAT sandviç yaparak birincil insan beyaz yağ dokusunu (WAT) kültleme yaklaşımını daha önce tanımlanmış bir şekilde uyarlar. BC-MPS’mizin yeni yönleri arasında BC hücrelerinin yerel hücre dışı matris, olgun adipositler, yerleşik fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri içeren hastalıksız insan meme dokusuna (HBT) tohumlama; ve BC-HBT admixture’ı HBT türevi ASC levhalar arasında sandviç. Elde edilen BC-MPS, kültür ex vivo’sunda en az 14 gün boyunca kararlıdır. Bu model sistemi, Adipositler, stromal hücreler, bağışıklık hücreleri ve hücre dışı matris dahil olmak üzere M.Ö.’yü etkileyen mikroçevrinin birden fazla unsurunu içerir. Böylece BC-MPS, BC ve mikroçevrim arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.

BC-MPS’mizin avantajlarını, kanserin ilerlemesini ve metastazını etkilediği bilinen iki BC davranışını inceleyerek gösteriyoruz: 1) BC hareketliliği ve 2) BC-HBT metabolik çapraz konuşma. BC hareketliliği daha önce intravital görüntüleme kullanılarak gösterilmiş olsa da, BC-MPS birkaç gün boyunca floresan mikroskopi kullanarak yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntülemeye izin verir. Ayrıca, metabolik çapraz konuşma daha önce bc hücreleri ve olgunlaşmamış adipositlere farklılaştırılmış murine pre-adipositler kullanılarak gösterilmiş olsa da, BC-MPS modelimiz birincil insan meme adipositleri ile BC hücreleri in vitro arasındaki bu çapraz sapı gösteren ilk sistemdir.

Introduction

Her yıl, 40.000’den fazla ABD’li kadın meme kanserinden ölüyor (M.Ö.1. Bc araştırmalarına yılda 700 milyon dolardan fazla yatırım olmasına rağmen, aday BC ilaçlarının% 97’si klinik çalışmalarda başarısız2,3. İlaç geliştirme boru hattını ve M.Ö. anlayışımızı geliştirmek için yeni modellere ihtiyaç vardır. NIH Mikrofizyolojik (MPS) Programı, temel bilimi klinik başarıya çevirmek için çığır açan modeller için gerekli özellikleri tanımlamamıştır4. Bunlar arasında birincil insan hücrelerinin veya dokularının kullanımı, 4 hafta boyunca kültürde stabil ve doğal doku mimarisinin ve fizyolojik yanıtın dahil edilmesi yer aldı.

BC hücre çizgilerinin iki boyutlu kültürü, membran kesici uç ortak kültürü ve üç boyutlu küreseller ve organoidler gibi mevcut in vitro BC modelleri NIH’nin MPS kriterlerini karşılamaz, çünkü bunların hiçbiri yerel meme dokusu mimarisini yeniden tamamlamaz. Bu sistemlere hücre dışı matris (ECM) eklendiğinde meme ECM kullanılmaz; bunun yerine kollajen jelleri ve bodrum membran matrisleri kullanılır.

Hasta türevli ksinograftlar (PDX) gibi mevcut in vivo sistemler de benzer şekilde NIH’nin MPS kriterlerini karşılamamaktadır, çünkü murine meme dokuları insan göğüslerinden büyük ölçüde farklıdır. Ayrıca, immün sistem-BC etkileşimleri tümör gelişiminde giderek daha fazla anahtar olarak kabul edilmektedir, ancak PDX tümörleri üretmek için kullanılan immün sistemi baskılanmış murin modelleri olgun T hücreleri, B hücreleri ve doğal öldürücü hücrelerden yoksundur. Ayrıca, PDX primer meme tümörlerinin korunmasına ve genişletilmesine izin verirken, ortaya çıkan PDX tümörleri primer murine stromal hücreler ve ECM5ile sızmaktadır.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, NIH MPS kriterlerini karşılayan bir roman, ex vivo, üç boyutlu insan göğsü MPS geliştirdik. Meme MPS’mizin temeli, birincil insan meme dokusunun (HBT) HBT’den izole edilmiş iki yağ türevi kök hücre (ASC) yaprağı arasına sandviç yapılmasıyla yapılır (Şekil 1). Hücre yapraklarını sandviç HBT’ye aktarmak için pistonlar 3D baskılı veya basit akrilik plastiklerden yapılabilir(Şekil 1H,I). Bu teknik, birincil insan beyaz adiposit dokusunu kültleme için daha önce tarif ettiğimiz yaklaşımı uyarlar6,7. Meme MPS daha sonra standart BC hücre çizgilerinden primer insan meme tümörlerine kadar tercih edilen bir BC modeli ile tohumlanabilir. Burada, bu BC-MPS’lerin kültürde birkaç hafta boyunca istikrarlı olduğunu gösteriyoruz (Şekil 2); meme adipositleri, ECM, endotel, bağışıklık hücreleri gibi HBT’nin doğal unsurlarını içerir (Şekil 3); ve M.Ö. ile HBT arasındaki metabolik çapraz konuşma gibi fizyolojik etkileşimleri yeniden özetler (Şekil 4). Son olarak, BC-MPS’nin HBT boyunca BC hücrelerinin amipoid hareketinin incelenmesine izin verdiğini gösteriyoruz (Şekil 5).

Protocol

Tüm insan dokuları LSUHSC Kurumsal İnceleme Kurulu Ofisi tarafından onaylandığı şekilde protokol #9189 uygun olarak toplanarak toplandırıldı. 1. Hücre sayfaları için Yağ türevi Kök Hücrelerin (ASC) tohumlama Asc’leri ticari kaynaklardan satın alın veya belirlenen protokolleri izleyerek birincil insan meme dokusundan izole edin8,9. Dulbecco’nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) 6 kuyu standart doku kültürü pla…

Representative Results

Kültürde istikrarBC-MPS, en az 14 güne kadar in vitro olarak kültürlenebilen kararlı bir mikrofizyolojik sistemdir. Asc hücre sayfalarının parlak alan görüntüsü, birleştiği levhanın çizgili desenini görüntülemek için 100x büyütmede alınmıştır (Şekil 2A). ASC hücre sayfaları kültürde en az 4 hafta boyunca stabildir. BC-MPS kültürde 14 gün boyunca bir kuyuda 6 kuyu plakası, şamandıra HBT’nin 14 gün son…

Discussion

Hastalığın daha iyi anlaşılması için insan meme kanserinin modelleneceği yeni sistemlere ihtiyaç vardır. Yerli ECM ve stromal hücreleri içeren hastalık ayarlarını modellemek için insan mikrofizyolojik sistemlerinin geliştirilmesi, klinik öncesi çalışmaların tahmin gücünü artıracaktır. Burada sunulan BC-MPS modeli, önceki modellerin sınırlamalarını aşarak BC’nin kendi yerel HBT ortamında değerlendirilmesini sağlayan yeni geliştirilmiş bir sistemdir. Bu sistem kanser hücre hatları il…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tulane Akış Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdeği’nin yanı sıra Tulane Histoloji Çekirdeği’ne de teknik destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant ve National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854) tarafından desteklendi.

Materials

Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic – predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

Breast CancerMicrophysiological SystemEx VivoAdipocytesImmune CellsVascular StructuresDuctal StructuresExtracellular MatrixPersonalized MedicinePharmaceutical DevelopmentTumor InitiationFibrosisExtracellular Matrix RemodelingGelatinPNIPAAmASCsPBSRazor BladeCancer Cell LinesBC-MPS Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image