Modélisation du cancer du sein dans le tissu mammaire humain à l’aide d’un système microphysiologique
Summary
Ce protocole décrit la construction d’un système microphysiologique in vitro pour étudier le cancer du sein utilisant le tissu humain primaire de sein avec les matériaux de commerce.
Abstract
Le cancer du sein (C.-B.) demeure l’une des principales causes de décès chez les femmes. Malgré plus de 700 millions de dollars investis dans la recherche en Colombie-Britannique chaque année, 97 % des médicaments candidats de la Colombie-Britannique échouent aux essais cliniques. Par conséquent, de nouveaux modèles sont nécessaires pour améliorer notre compréhension de la maladie. Le programme de systèmes microphysiologiques (MPS) des NIH a été développé pour améliorer l’application clinique des découvertes scientifiques fondamentales et des nouvelles stratégies thérapeutiques prometteuses. Nous présentons ici une méthode de génération de MPS pour les cancers du sein (BC-MPS). Ce modèle adapte une approche précédemment décrite de culture du tissu adipeux blanc humain primaire (WAT) en prenant en sandwich WAT entre les feuilles de cellules souches adipeuses-dérivées (ASC) s. Les nouveaux aspects de notre BC-MPS comprennent l’ensemencement de cellules BC dans le tissu mammaire humain non malade (HBT) contenant la matrice extracellulaire native, les adipocytes matures, les fibroblastes résidents et les cellules immunitaires; et la prise en sandwich du mélange BC-HBT entre les feuilles ASC dérivées de HBT. Le BC-MPS résultant est stable en culture ex vivo pendant au moins 14 jours. Ce système modèle contient plusieurs éléments du microenvironnement qui influencent la Colombie-Britannique, y compris les adipocytes, les cellules stromales, les cellules immunitaires et la matrice extracellulaire. Ainsi, BC-MPS peut être utilisé pour étudier les interactions entre BC et son microenvironnement.
Nous démontrons les avantages de notre BC-MPS en étudiant deux comportements de BC connus pour influencer la progression et la métastase de cancer : 1) motilité de BC et 2) diaphonie métabolique de BC-HBT. Tandis que la motilité de BC a été précédemment démontrée utilisant l’imagerie intravital, BC-MPS tient compte de l’imagerie time-lapse à haute résolution utilisant la microscopie de fluorescence pendant plusieurs jours. En outre, tandis que la diaphonie métabolique a été précédemment démontrée utilisant des cellules de BC et des pre-adipocytes murins différenciés en adipocytes non mûrs, notre modèle de BC-MPS est le premier système à démontrer cette diaphonie entre les adipocytes mammaires humains primaires et les cellules de BC in vitro.
Introduction
Chaque année, plus de 40 000 femmes américaines meurent d’un cancer du sein (BC)1. Malgré plus de 700 millions de dollars investis dans la recherche en Colombie-Britannique chaque année, 97 % des médicaments candidats de la Colombie-Britannique échouent aux essais cliniques2,3. De nouveaux modèles sont nécessaires pour améliorer le pipeline de développement de médicaments et notre compréhension de la Colombie-Britannique. Le programme microphysiologique (MPS) des NIH a délimité les caractéristiques requises pour des modèles révolutionnaires visant à améliorer la traduction de la science fondamentale en succès clinique4. Ceux-ci comprenaient l’utilisation de cellules ou de tissus humains primaires, stables en culture pendant 4 semaines, et l’inclusion de l’architecture tissulaire native et de la réponse physiologique.
Les modèles actuels in vitro de BC, tels que la culture bidimensionnelle des variétés de cellule de BC, la co-culture d’insertion de membrane, et les sphéroïdes et organoïdes tridimensionnels, ne répondent pas aux critères de MPS des NIH parce qu’aucun de ces derniers récapitule l’architecture native de tissu de sein. Lorsque la matrice extracellulaire (ECM) est ajoutée à ces systèmes, l’ECM du sein n’est pas utilisée; au lieu de cela, des gels de collagène et des matrices de membrane basale sont utilisés.
Les systèmes in vivo actuels, tels que les xénogreffes dérivées de patients (PDX), ne répondent pas de même aux critères de MPS des NIH parce que les tissus mammaires murins diffèrent considérablement des seins humains. D’ailleurs, les interactions système immunitaire-BC sont de plus en plus reconnues comme clés dans le développement de tumeur, mais les modèles murins immunocompromised utilisés pour générer des tumeurs pdx manquent des cellules T mûres, des cellules de B, et des cellules tueuses naturelles. En outre, tandis que PDX permet aux tumeurs primaires de sein d’être maintenues et développées, les tumeurs de PDX résultantes sont infiltrées avec les cellules stromal murines primaires et l’ECM5.
Pour surmonter ces défis, nous avons développé un nouveau, ex vivo, mps humain tridimensionnel de sein qui répond aux critères de MPS nih. La base de notre MPS mammaire est faite en sandwichant le tissu mammaire humain primaire (HBT) entre deux feuilles de cellules souches dérivées de l’adipose (ASC), également isolées de HBT (Figure 1). Les pistons pour le transfert des feuilles de cellules en sandwich le HBT peuvent être imprimés en 3D ou fabriqués à partir de plastiques acryliques simples(Figure 1H,I). Cette technique adapte notre approche précédemment décrite pour la culture du tissu adipocytaire blanc humain primaire6,7. Le mps de sein peut alors être ensemencé par un modèle de BC de choix, s’étendant des variétés de cellule standard de BC aux tumeurs humaines primaires de sein. Ici, nous montrons que ces BC-MPS sont stables en culture pendant plusieurs semaines (Figure 2) ; inclure des éléments natifs de l’HBT tels que les adipocytes mammaires, l’ECM, l’endothélium, les cellules immunitaires (Figure 3); et récapituler les interactions physiologiques entre BC et HBT telles que la diaphonie métabolique (Figure 4). Enfin, nous montrons que BC-MPS permet l’étude du mouvement amiboïde des cellules BC dans tout HBT (Figure 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
De nouveaux systèmes de modélisation du cancer du sein humain sont nécessaires pour mieux comprendre la maladie. Le développement de systèmes microphysiologiques humains pour modéliser les contextes de la maladie qui incluent des cellules PHY et stromales natives augmentera le pouvoir prédictif des études précliniques. Le modèle BC-MPS présenté ici est un système nouvellement développé qui surmonte les limites des modèles précédents permet l’évaluation de BC dans son environnement HBT natif. Ce syst?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le tulane flow cytometry et le cell sorting core ainsi que le Tulane Histology Core pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par la southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant et la National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).
Materials
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
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