이 프로토콜은 표현형 마이크로어레이(PM) 기술 플랫폼을 사용하여 녹색 미세조류인 클라미도모나스 레인하르트티의 대사 요건을 정의하고 기존 대사 네트워크 모델을 구체화하는 것을 보여줍니다.
신진 대사 모델은 유기체의 사용 가능한 게놈 성서에 따라 재구성되고 시스템 수준에서 신진 대사 과정을 연구할 수있는 예측 도구를 제공합니다. 게놈 규모 대사 모델은 실험적으로 확인되지 않은 반응뿐만 아니라 갭을 포함할 수 있다. 새로 고립 된 미세 조류 종의 재구성 된 모델은 이러한 분리물의 대사에 사용할 수있는 일반적으로 희소한 생화학 적 증거가 있기 때문에 이러한 격차로 인해 약점을 초래할 것입니다. 표현형 마이크로어레이(PM) 기술은 다양한 항목 대사산물에 대응하여 세포 대사 활동을 기능적으로 결정하는 효과적인 고처리량 방법입니다. 높은 처리량 현상제 분석을 대사 모델링과 결합하면 기존의 신진 대사 네트워크 모델이 유전체 증거를 지원하고 확장하기 위해 생화학적 증거를 제공함으로써 빠르게 재구성하거나 최적화될 수 있습니다. 이 연구는 녹색 미세 조류 모델 종 Chlamydomonas reinhardtii를 예로 사용하여 미세 조류연구를 위한 PM 애서의 사용을 보여줍니다. PM에 의해 얻어진 254개 이상의 반응에 대한 실험적 증거는 이 연구에서 게놈 규모의 C. reinhardtii 대사 네트워크 모델iRC1080을 약 25% 확장하고 정제하는 데 사용되었습니다. 여기에서 생성된 프로토콜은 알려진 미세 조류 돌연변이및 새로운 분리제를 포함하여 다른 미세 조류의 신진 대사를 기능적으로 프로파일링하기 위한 기초로 사용될 수 있다.
표적 대사 산물의 향상되고 안정적인 생산을 위한 조류 대사를 최적화하려면 신진 대사 네트워크의 시스템 수준 분석을 통해 복잡한 신진 대사 엔지니어링 전략의 개발이 필요합니다. 신진 대사 네트워크 모델은 최적화전략1,2,3,4의급속한 발전을위한 합리적인 디자인을 안내 할 수 있습니다. 약 160개의 미세조류종이 5개 시퀀시되었지만, 우리의 지식에는 44개의 조류 대사 모델만4,6,7을사용할 수 있다. 게놈 정보의 실험적 검증을 위한 고처리량 대사 현상제 데이터를 얻는 데 어려움이 있기 때문에, 고품질 네트워크 모델의 재구성은 조류 게놈 시퀀싱의 급속한 발달에 뒤쳐진다.
C. reinhardtii는 조류 기반 연구를위한 매력적인 모델 시스템입니다. 이 종은 광연 또는 이종성 또는 이종성으로 성장할 수 있으며 기본 및 적용 연구에서 모델 유기체로 널리 사용되어 왔습니다. 그것의 게놈 순서는 2007년에 간행되었습니다8,게놈 규모의 신진 대사 모형은 이후에 종9,10,11를위해 재구성되었습니다. C. reinhardtii (iRC1080)에 대한 게놈 스케일 모델은 장 외에 의해 재구성되었다. 10 게놈 및 문학 증거에 따라 (수반 ~ 250 소스). 그것은 있다 1,706 대사 산물 와 2,190 반응10; 그러나 모델의 완전성은 당시 사용 가능한 게시된 실험 증거를 넘어서는 확인할 수 없었습니다.
표현형 미생물어레이(PMs) 기술은 이성영양 미생물뿐만 아니라 조직 배양 세포에 대한 대사 프로파일링 정보를 제공할 수 있는 고처리량 플랫폼이다. 특히, 클라미도모나스 레인하르트티(12)에대해 최초보고된 바와 같이, 마이크로조류에서 표현형-유전자형 지식 격차를 해결하는 데 사용될 수 있으며, 이후 클로로이듐13 및 클로렐라(14)의 종에 대해 서술할 수 있다. 수천 개의 대사 산물, 신호 분자, 삼투혈, 이펙터 분자에 대한 세포 반응을 연구함으로써 PM 에세이는 기능성 대사 프로파일링을 제공하고 기능, 신진 대사 및 환경 민감도15,16,17에대한 통찰력을 제공할 수 있다. 구체적으로, PM 어약은 각 우물에 포함된 다른 양분, 대사 산물 또는 삼투석이 있는 96웰 마이크로플레이트에서 세포 대사산물 활용을 검출한다. 또한 항생제 및 호르몬과 같은 생리 활성 분자를 분석할 수도 있습니다. 테트라졸륨 계 제독염의 NADH 감소에 의한 색 생산의 강도에 의해 결정된 바와 같이, 기판의 대사 활용은 세포호흡(15,16,17)의관점에서 평가된다. 96웰 마이크로플레이트의 실험은 표현형 마이크로어레이 기기(PMI) 플랫폼을 통해 시간이 지남에 따라 자동으로 모니터링및 확인할 수 있습니다. 20 96웰 마이크로플레이트는 다른 삼투성/이온 및 pH 효과와 함께 탄소, 질소, 황 및 인 소스를 활용하기 위해 세포 표현형을 연구하기 위해 일반적인 세트 대사 산물을 나타내도록 설계되었습니다. PM기술은 미생물15,16,17,18에대한 다수의 기존 게놈 규모의 대사 모델을 업데이트하고 업그레이드하는 데 성공적으로 사용되어 왔다.
여기에 표시된 프로토콜 및 데이터는 Chaiboonchoe 등의 이전에 게시 된 작품을 기반으로합니다. 12 제시된 작품에서는 미세조류의 대사 표현형을 특성화하고 C. reinhardtii의 기존 조류 대사 모델을 확장하고 새로운 대사 모델의 재구성을 안내하기 위해 PM 분석 방법의 사용을 상세히 설명합니다.
녹색 미세알가, C. reinhardtii의대사 표현은 여기에서 높은 처리량 PM 분석 플레이트 및 수정되지 않은 PMI를 사용하여 설명되었다. 이 소는 펩타이드 질소 공급원(PM06-08)과 함께 총 190개의 탄소 공급원(PM01 및 PM02), 95개의 질소 공급원(PM03), 59개의 인 소스 및 35개의 황 공급원(PM04)을 위해 활용되었다. 양성 호흡은 148개의 영양소(C-source 활용을 위한 1개의 긍정적인 분석, 각각S-source 및 P-source 활용에 대한 4개의 긍정적인 분석, 그리고 N-source 활용을 위한 139개의 양성 분석)에 대해 관찰되었다. 매체의 기질 또는 영양소(탄소, 질소, 인 또는 유황) 성분은 각 소스에 대해 테스트하는 관련 PM 마이크로플레이트에 적용될 때 정의된 매체에 첨가해서는 안 된다.
여기에 도시된 방법은 기존 대사 네트워크 모델을 확장하거나 새로운 모델의 재구성을 지시하는 데 사용될 수 있는 대사 미세조류 표현형을 특성화하는 데 효과적이다. 또한 대부분의 미세 조류의 영양 요구 사항이 알려지지 않았기 때문에 이 플랫폼을 사용하여 이러한 플랫폼을 신속하게 정의할 수 있습니다. 넬슨 외. 43은 이러한 방법을 성공적으로 적용하여 미세조류 클로로이듐 Sp의 성장을 지원하는 새로운 화합물을 식별하고, 클라미도모나스와 는 달리 40개의 다른 탄소 공급원을 포함하는 종 진입 대사산물을 정의하는 데 얻은 정보를 사용했다.
미세 조류 프로파일링을위한 PM의 한 가지 주요 제한은 PMI가 잠복실에 조명이 없고 미세 조류가 이종국 대사를 수행 할 수 있어야한다는 것입니다. 빛의 부재는 신진 대사 플럭스를 계산하기 위해 빛을 통합 하는 모델의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 조정 기능을 갖는 유전자 쌍은 신진 대사 네트워크 허브를 구성하기 위해 공동 진화하였으며 광합성 및 비광합성 네트워크 허브 간의 구별을44로만들 수 있다. 일반적으로 광합성 네트워크 허브(예: 모델의 고도로 연결된 노드)는 이종성 모델에서 제외됩니다. 실용적인 목적을 위해, mixotrophic 종에서 이종성 위를 모델링하는 것은 빛에 의해 구동되는 것으로 알려진 반응을 생략하고 조건 간의 에너지 균형 차이를 설명해야합니다. 따라서, 빛에 의존적이고 가벼운 독립적인 신진대사를 모델링하는 것은 클라미도모나스 대사 모델링6,45에서표준 관행이다.
Trebouxiophytes 같이 몇몇 녹색 미세조류는, 성장을 위한 탄소 분자의 다양한 동화하기 위하여 알려지고, 이것은 lichens의 일원으로 그들의 긴 진화 역사에서 생겨난 것으로 생각됩니다46. 클라미도모나스와 같은 엽록소는 성장을 위해 아세테이트를 사용할 수 있지만, 매우 긴 사슬의 고도 불포화 지방산(VLC-PUFA)을 상업적으로 생산할 수 있는 잠재력으로 알려진 갈색 해양 미세알가 티조크리시스 루테아는 아세테이트를 사용할 수 없지만47년성장을 위해 글리세롤을 사용할 수 있다. 100gl-1 건조 세포 중량의 바이오매스 농도는 공급 배치 모드48에유기 탄소 원을 최적화한 첨가와 함께 클로렐라로 달성되었다. 또한, 클로렐라불가리에 설탕을 첨가하면CO2의 격리를 촉진하여 광합성 성장 시 첨가제 혜택을 제공할 수있다(49). 대부분의 이종국형 미세조류는 혼합형으로 성장할 수 있지만, 엽록토 염색체 소포링기엔시스는 설탕50을첨가하면 광합성을 차단하는 것으로 나타났다.
디아톤, 분열 바실라리오피타에 속하는, 식물성 플랑크톤의 주요 그룹입니다. 대부분의 투이음은 광토영양적으로만 성장할 수 있지만, 그 중 일부는 혼합또는 이종성51을재배할 수 있다. 예를 들어, 글리세롤은 모델 종 Phaeodactylum tricornutum(52)을포함하는 일부 규음에서CO2가 없는 상태에서 빛의 성장을 지원하는 것으로 나타났다. 또한, 니츠치아 리니시스와 같은 일부 벤딕 규격은 어두운53에서탄수화물에서 자랄 수 있다. 세포가 이종성으로 성장할 수 있도록 적절한 유기 탄소 원을 보충함으로써 PM 측정기 및 기타 조류 그룹에 PM 애서를 확장할 가능성이 있으며, 혼합 측위 전략은 최소한의 필수 광 공급을 제공하는 의무 적인 자가 영양축미세 조류에 잠재적으로 사용될 수 있습니다.
데이터의 재현성을 평가하기 위해 모든 플레이트에 대해 중복 분석방법을 수행하는 것이 좋습니다. 분석은 음의 제어 및 각각의 빈 우물에서 빼낸 후, 흡광도(PMI 값)가 양성인 경우에만 양성으로 간주될 수 있다. 이 설명은, 시험된 화합물의 존재에서, 염료의 생체 내 반응을 배지와 반영한다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업에 대한 주요 지원은 뉴욕 대학 아부다비 연구소 보조금 (73 71210 CGSB9)과 NYU 아부 다비 교수 연구 기금 (AD060)에서 탐킨에 의해 투자, 유전체학 및 시스템 생물학을위한 NYUAD 센터에 의해 제공되었다. W.F.는 절강대학교 백 인재 프로그램에 추가로 지원되었다. 아시쉬 자이스왈에게 비디오 녹화에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 신진대사 표현형 데이터를 생성해 주신 홍카이에게 감사드립니다.
Ampicillin | VWR | 97062-796 | |
Biolog assay plates [ PM01-08] | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Biolog Omnilog Instrument | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503 | Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA. | Regents of the University of Minnesota | |
Kanamycin | VWR | 0408-EU-10G | |
Tetrazolium Violet Dye “D” | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Timentin | GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd | 42010012-2 |