פרוטוקול זה מדגים את השימוש בפלטפורמת טכנולוגיית microarray פנוטיפ (PM) כדי להגדיר דרישות מטבוליות של כלמידומונס ריינהרדטי, מיקרו-ריאלגה ירוקה, ולחדד מודל רשת מטבולית קיים.
מודלים מטבוליים משוחזרים על בסיס ביאור הגנום הזמין של אורגניזם ומספקים כלים חזויים לחקר תהליכים מטבוליים ברמת המערכות. מודלים מטבוליים בקנה מידה גנומי עשויים לכלול פערים, כמו גם תגובות שאינן מאומתות באופן ניסיוני. מודלים משוחזרים של מינים מיקרו-גלגליים מבודדים חדשים יגרמו לחולשות בשל פערים אלה, שכן בדרך כלל יש ראיות ביוכימיות דלילות זמינות לחילוף החומרים של מבודדים כאלה. טכנולוגיית הפנוטיפ microarray (PM) היא שיטה יעילה, תפוקה גבוהה הקובעת פונקציונלית פעילויות מטבוליות הסלולר בתגובה למגוון רחב של מטבוליטים כניסה. שילוב של בדיקות פנוטיפיות בתפוקה גבוהה עם מידול מטבולי יכול לאפשר מודלים קיימים של רשת מטבולית להיות משוחזרים במהירות או ממוטבים על ידי מתן ראיות ביוכימיות כדי לתמוך ולהרחיב ראיות גנומיות. עבודה זו תציג את השימוש בבדיקות PM לחקר אצות מיקרו באמצעות מינים מודל מיקרו-גלרי ירוק Chlamydomonas reinhardtii כדוגמה. ראיות ניסיוניות עבור מעל 254 תגובות שהושגו על ידי PM שימש במחקר זה כדי להרחיב ולזקק מודל רשת מטבולית בקנה מידה גנום C. reinhardtii, iRC1080, על ידי כ 25 אחוזים. הפרוטוקול שנוצר כאן יכול לשמש כבסיס ליצירת פרופיל תפקודי של חילוף החומרים של מיקרו-אצות אחרות, כולל מוטציות מיקרו-אצות ידועות ומבודדים חדשים.
אופטימיזציה של חילוף החומרים האצות לייצור משופר ויציב של מטבוליטים ממוקדים דורש פיתוח של אסטרטגיות הנדסיות מטבוליות מורכבות באמצעות ניתוחים ברמת המערכות של רשתות מטבוליות. מודלים של רשת מטבולית יכולים להנחות את העיצובים הרציונליים לפיתוח מהיר של אסטרטגיותאופטימיזציה 1,2,3,4. למרות כ 160 מינים microalgal כבררצף 5, יש, למיטב ידיעתנו, רק 44 מודלים מטבוליים אצות זמין4,6,7. בשל הקושי להשיג נתונים פנוטיפיים מטבוליים בעלי תפוקה גבוהה לאימות ניסיוני של מידע גנומי, שחזור מודלים איכותיים של רשת מפגר מאחורי ההתפתחות המהירה של ריצוף הגנום האצות.
C. reinhardtii היא מערכת מודל אטרקטיבית למחקרים מבוססי אצות. מין זה יכול לגדול פוטואוטוטרופית או הטרוטרופית והיה בשימוש נרחב כאורגניזם מודל במחקר בסיסי ויישומי. רצף הגנום שלה פורסם בשנת 20078, עם מודלים מטבוליים בקנה מידה גנום לאחר מכן שוחזר עבור המינים9,10,11. המודל בקנה מידה הגנום עבור C. reinhardtii (iRC1080) שוחזר על ידי צ’אנג ואח ‘. 10 מבוסס על עדויות גנומיות וספרותיות (הכרואות כ -250 מקורות). יש לו 1,706 מטבוליטים עם 2,190 תגובות10; עם זאת, לא ניתן היה לאמת את שלמות המודל מעבר לראיות הניסוייות הזמינות שפורסמו באותה עת.
טכנולוגיית המיקרואורגניזמים הפנוטיפ (PMs) היא פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה שיכולה לספק מידע פרופיל מטבולי עבור מיקרואורגניזמים הטרוטרופיים כמו גם תאים של תרבית רקמות. בפרט, ניתן להשתמש בו כדי לטפל בפער הידע פנוטיפ לגנוטיפ במיקרו-אצות, כפי שדווח לראשונה עבור כלמידומונס ריינהרדטי12 ולאחר מכן עבור מין של כלורוידיום13 וכלורלה14. על ידי לימוד תגובות תאים לאלפי מטבוליטים, מולקולות איתות, אוסמוליטים ומולקולות אפקטים, בדיקות ראש הממשלה יכולות לספק פרופיל מטבולי תפקודי ולהציע תובנות על התפקוד, חילוף החומרים והרגישות הסביבתית15,16,17. באופן ספציפי, בדיקות PM לזהות ניצול מטבוליט תאים 96-היטב microplates עם חומרים מזינים שונים, מטבוליטים, או osmolytes הכלולים בכל באר. יתר על כן, ניתן גם לאתחל מולקולות ביואקטיביות, כגון אנטיביוטיקה והורמונים. כפי שנקבע על ידי עוצמת ייצור הצבע על ידי הפחתת NADH של צבע redox מבוסס טטרזוליום, ניצול מטבולי של מצעים מוערך במונחים של נשימה התא15,16,17. הניסויים במיקרו-לוחות 96-באר ניתן לפקח ולהיקבע באופן אוטומטי לאורך זמן עם פלטפורמת מכשיר microarray פנוטיפ (PMI). עשרים מיקרו-לוחות בעלי 96 באר נועדו לייצג את המטבוליטים הנפוצים לחקר פנוטיפים תאיים כדי להשתמש במקורות פחמן, חנקן, גופרית וזרחן, יחד עם השפעות אוסמוטיות/יונים ו-pH שונות. טכנולוגיית PM שימשה בהצלחה לעדכון ושדרוג של מספר מודלים מטבוליים קיימים בקנה מידה גנומי עבור מיקרואורגניזמים15,16,17,18.
הפרוטוקול והנתונים המוצגים כאן מבוססים על עבודה שפורסמה בעבר על ידי Chaiboonchoe et al. 12 העבודה המוצגת מפרטת את השימוש בשיטת בדיקות PM כדי לאפיין את הפנוטיפים המטבוליים של מיקרו-אצות ולהרחיב מודל מטבולי אצות קיים של C. reinhardtii וכן להנחות את השחזור של מודלים מטבוליים חדשים.
פנוטיפינג מטבולי של microalga ירוק, C. reinhardtii, תואר כאן באמצעות צלחות בדיקה PM תפוקה גבוהה PMI לא שטופת. בדיקות החנקן נוצלו בסך הכל 190 מקורות פחמן (PM01 ו- PM02), 95 מקורות חנקן (PM03), 59 מקורות זרחן ו -35 מקורות גופרית (PM04), יחד עם מקורות חנקן פפטיד (PM06-08). נשימה חיובית נצפתה עבור 148 חומרים מזינים (מבחן חיובי אחד לניצול מקור C, ארבע בדיקות חיוביות עבור כל שימוש במקור S ו- P-source, ו 139 בדיקות חיוביות לניצול מקור N). אין להוסיף את רכיב המצעים או החומרים המזינים (פחמן, חנקן, זרחן או גופרית) של המדיה למדיום המוגדר כאשר הם מוחלים על מיקרו-לוחות ראש הממשלה הרלוונטיים הבודקים עבור כל אחד מאותם מקורות.
השיטה המוצגת כאן יעילה לאפיון פנוטיפים מיקרו-אצות מטבוליות שניתן להשתמש בהם כדי להרחיב את מודלי הרשת המטבולית הקיימים או לכוון את השחזור של מודלים חדשים. יתר על כן, כמו הדרישות התזונתיים של רוב microalgae אינם ידועים, פלטפורמה זו יכולה לשמש כדי להגדיר אלה במהירות. נלסון ואח. 43 יישם בהצלחה שיטות אלה כדי לזהות תרכובות חדשות התומכות בצמיחה של כלורוידיום microalgae sp. UTEX 3007 והשתמש במידע המתקבל כדי להגדיר את מטבוליטים הכניסה למינים, אשר, בניגוד לכלמידומונס, כוללים 40 מקורות פחמן שונים.
מגבלה מרכזית אחת של ראש הממשלה ליצירת פרופיל של מיקרו-אצות היא של-PMI אין תאורה בתא הדגירה, והמיקרו-אצות צריכות להיות מסוגלות לבצע חילוף חומרים הטרוטרופי. היעדר אור יכול להשפיע על הפרשנות של מודלים המשלבים אור לחישוב שטפים מטבוליים. זוגות גנים עם פונקציות תיאום התפתחו במשותף כדי להוות רכזות רשת מטבוליות, ואת ההבחנה בין רכזות רשת פוטוסינתזה ולא פוטוסינתזה יכול להיעשות44. באופן כללי, רכזות רשת פוטוסינתזה (כלומר, צמתים מחוברים מאוד במודל) יישארו מחוץ לדגמים הטרוטרופיים. למטרות מעשיות, מידול הטרוטרופיזם במינים מיקסוטרופיים צריך להשמיט תגובות הידועות כמונעות על ידי אור ולחשב על ההבדלים מאזן האנרגיה בין התנאים. לכן, מידול חילוף החומרים תלוי אור ולטהות אור הוא נוהג מקובל בכלמידומונס מידול מטבולי6,45.
כמה מיקרו-אצות ירוקות, כמו טרבוקיופיטים, ידועות כמטמיעות מגוון מולקולות פחמן לצמיחה, וזה נחשב כמי שצמח מההיסטוריה האבולוציונית הארוכה שלהן כחברים בחזזיות46. בעוד כלורופיטים כמו כלמידומונס יכולים להשתמש אצטט לצמיחה, מיקרואלגה ימית חומה Tisochrysis lutea, הידועה בפוטנציאל שלה לייצר באופן מסחרי חומצות שומן רב בלתי רוויות בשרשרת ארוכה מאוד (VLC-PUFAs), אינה יכולה להשתמש באצטט אך יכולה להשתמש בגליצרול לצמיחה47. ריכוז ביומסה של יותר מ 100 גרם l−1 משקל תא יבש הושג עם כלורלה עם תוספת אופטימלית של מקורות פחמן אורגני במצב אצווה48. כמו כן, תוספת של סוכר כלורלאבולגאריס יכול להעלות את ההרחבה שלה של CO2, ובכך לספק יתרון תוסף במהלך צמיחה פוטוסינתזה49. רוב המיקרו-אצות הטרוטרופיות יכולות גם לגדול באופן מיקסוטרופי, אבל כלורופיט כרומוכלוריס זופינגיאנסיס הוכח ככיבוי פוטוסינתזה בתוספת סוכר50.
הצורניות, המשתייכות למחלקה בסילאריופיטה, הן קבוצה גדולה של פיטופלנקטון. למרות שרוב הצורניות יכולות לגדול רק פוטואוטוטרופית, חלקם ניתן לטפח מיקסוטרופית או הטרוטרופית51. לדוגמה, גליצרל נמצאה כתומכת בצמיחה באור בהיעדר CO2 בכמה הצורניות, כולל מינים מודל Phaeodactylum tricornutum52. כמו כן, כמה הצורניות הבנטיות כמו ניטשיה לינאריס יכולות לגדול על פחמימות בחושך53. זה עשוי להרחיב את בדיקות ראש הממשלה הצורניות וקבוצות אצות אחרות על ידי שכשהם מקורות פחמן אורגניים מתאימים כדי לאפשר לתאים לגדול הטרוטרופית, ואסטרטגיית מיקסוטרופיה יכולה לשמש גם עבור מיקרו-אצות אוטוטרופיות חובה המספקות אספקת אור מינימלית נדרשת.
כדי להעריך את יכולת הרבייה של הנתונים, מומלץ מאוד לבצע התקפות כפולות עבור כל הצלחות. בדיקה עשויה להיחשב חיובית רק אם, לאחר חיסור מהפקד השלילי והבארות הריקות המתאימות, הספיגה (ערך PMI) חיובית. תיאור זה, בנוכחות המתחם שנבדק, הוא השתקפות של התגובה האביוטית של הצבע עם המדיום.
The authors have nothing to disclose.
תמיכה משמעותית בעבודה זו ניתנה על ידי מרכז NYUAD לביולוגיה גנומיקה ומערכות (CGSB), במימון Tamkeen תחת מענק מכון המחקר של אוניברסיטת ניו יורק אבו דאבי (73 71210 CGSB9) וקרנות המחקר של הפקולטה לאבו דאבי של אוניברסיטת ניו יורק (AD060). ארגון W.F. נתמך בנוסף על ידי תוכנית מאה הכישרונות של אוניברסיטת ג’ה-ג’יאנג. אנו מודים לאשיש ג’איסוואל על העזרה בהקלטת הסרטון. אנו מודים להונג קאי על יצירת נתוני פנוטיפ מטבולי.
Ampicillin | VWR | 97062-796 | |
Biolog assay plates [ PM01-08] | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Biolog Omnilog Instrument | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503 | Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA. | Regents of the University of Minnesota | |
Kanamycin | VWR | 0408-EU-10G | |
Tetrazolium Violet Dye “D” | Biolog, Hayward, CA, USA | ||
Timentin | GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd | 42010012-2 |