يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لهضم الكولاجين لعزل الخلايا الشحمية القابلة للحياة وخلايا جزء الأوعية الدموية اللحمية من الدهون الحشوية البشرية في عملية واحدة ، بما في ذلك منهجية الحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا الشحمية والتنميط الظاهري لبلاعم SVF من خلال تلطيخ علامات متعددة مرتبطة بالغشاء لتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
الأنسجة الدهنية الحشوية (VAT) هي عضو استقلابي نشط يتكون أساسا من الخلايا الشحمية الناضجة وخلايا الجزء الوعائي اللحمي (SVF) ، والتي تطلق جزيئات نشطة بيولوجيا مختلفة تتحكم في العمليات الأيضية والهرمونية والمناعية. حاليا ، من غير الواضح كيف يتم تنظيم هذه العمليات داخل الأنسجة الدهنية. لذلك ، فإن تطوير طرق تقييم مساهمة كل مجموعة خلايا في الفيزيولوجيا المرضية للأنسجة الدهنية أمر بالغ الأهمية. يصف هذا البروتوكول خطوات العزل ويوفر إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها اللازمة للعزل الفعال للخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة و SVF من خزعات ضريبة القيمة المضافة البشرية في عملية واحدة ، باستخدام تقنية الهضم الأنزيمي كولاجيناز. علاوة على ذلك ، تم تحسين البروتوكول أيضا لتحديد مجموعات فرعية من البلاعم وإجراء عزل الحمض النووي الريبي للخلايا الشحمية الناضجة لدراسات التعبير الجيني ، مما يسمح بإجراء دراسات تشريح التفاعل بين مجموعات الخلايا هذه. باختصار ، يتم غسل خزعات ضريبة القيمة المضافة ، وفرمها ميكانيكيا ، وهضمها لتوليد تعليق أحادي الخلية. بعد الطرد المركزي ، يتم عزل الخلايا الشحمية الناضجة عن طريق التعويم من حبيبات SVF. يضمن بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي إنتاجية عالية من إجمالي الحمض النووي الريبي (بما في ذلك miRNAs) من الخلايا الشحمية لمقايسات التعبير النهائية. في الوقت نفسه ، يتم استخدام خلايا SVF لتوصيف مجموعات فرعية من البلاعم (النمط الظاهري المؤيد والمضاد للالتهابات) من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي.
لا تتكون الأنسجة الدهنية البيضاء من الخلايا الدهنية أو الخلايا الشحمية فحسب ، بل تتكون أيضا من جزء من الخلايا غير الدهنية يعرف باسم جزء الأوعية الدموية اللحمية (SVF) ، والذي يحتوي على مجموعة خلايا غير متجانسة تتكون من الضامة ، والخلايا المناعية الأخرى كخلايا تائية تنظيمية (Tregs) ، وحمضات ، وخلايا preadipocytes ، وخلايا ليفية ، محاطة بأنسجة وعائية وضامة 1,2. تعتبر الأنسجة الدهنية (AT) الآن عضوا ينظم العمليات الفسيولوجية المتعلقة بالتمثيل الغذائي والالتهاب من خلال الأديبوكينات والسيتوكينات والحمض النووي الريبي الدقيق الذي تنتجه وتطلقه خلايا مختلفة في الأنسجة ، مع تأثيرات autocrine و paracrine والغدد الصماء 3,4. في البشر ، تشتمل الأنسجة الدهنية البيضاء على الأنسجة الدهنية تحت الجلد (SAT) والأنسجة الدهنية الحشوية (VAT) ، مع اختلافات تشريحية وجزيئية وخلوية وفسيولوجية مهمة بينهما 2,5. يمثل SAT ما يصل إلى 80٪ من ATالبشري ، بينما تقع ضريبة القيمة المضافة داخل تجويف البطن ، بشكل رئيسي في المساريق والثرب ، كونها أكثر نشاطا من الناحية الأيضية6. علاوة على ذلك ، فإن ضريبة القيمة المضافة هي عضو في الغدد الصماء يفرز وسطاء لهم تأثير كبير على وزن الجسم وحساسية الأنسولين واستقلاب الدهون والالتهابات. وبالتالي ، يؤدي تراكم ضريبة القيمة المضافة إلى السمنة في منطقة البطن والأمراض المرتبطة بالسمنة مثل مرض السكري من النوع 2 ، ومتلازمة التمثيل الغذائي ، وارتفاع ضغط الدم ، ومخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية ، مما يمثل مؤشرا أفضل للوفيات المرتبطة بالسمنة6،7،8،9.
في ظروف الاستتباب ، تتعاون الخلايا الشحمية والبلاعم والخلايا المناعية الأخرى للحفاظ على استقلاب ضريبة القيمة المضافة من خلال إفراز وسطاء مضادين للالتهابات10. ومع ذلك ، فإن التوسع المفرط في ضريبة القيمة المضافة يعزز تجنيد الخلايا التائية المنشطة والخلايا القاتلة الطبيعية والبلاعم. في الواقع ، في ضريبة القيمة المضافة الخالية من الدهون ، تبلغ نسبة البلاعم 5٪ ، بينما ترتفع هذه النسبة إلى 50٪ في السمنة ، مع استقطاب البلاعم من النمط الظاهري المضاد للالتهابات إلى النمط الظاهري المؤيد للالتهابات ، مما يولد بيئة التهابية مزمنة10,11.
نتيجة لوباء السمنة ، نشأ عدد مذهل من التقارير التي تتناول مواضيع بحثية مختلفة لضريبة القيمة المضافة ، بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الدهنية ، وعلم التخلق ، والالتهابات ، وخصائص الغدد الصماء ، والمناطق الناشئة مثل الحويصلات خارج الخلية ، من بين أمور أخرى8،10،12،13. ومع ذلك ، على الرغم من أن بيئة ضريبة القيمة المضافة يتم تعريفها من خلال الحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية والبلاعم المقيمة أو القادمة ، فقد ركزت معظم الدراسات على مجموعة خلايا واحدة فقط ، وهناك معلومات نادرة حول تفاعل هذه الخلايا في ضريبة القيمة المضافة وعواقبها الفسيولوجية المرضية11,14. علاوة على ذلك ، تم إجراء دراسات قيمة تتناول تفاعل الخلايا الشحمية والبلاعم في AT باستخدام خطوط الخلايا ، وتفتقر إلى ظروف التحضير في الجسم الحي 11،14،15. تتطلب الإستراتيجية المناسبة لتشريح التفاعل أو المساهمة الخاصة لهذه الخلايا في ضريبة القيمة المضافة عزل كلا النوعين من الخلايا عن نفس خزعة الدهون لإجراء فحوصات في المختبر تعكس قدر الإمكان الخصائص في الجسم الحي التي تنظم عملية التمثيل الغذائي لضريبة القيمة المضافة.
على الرغم من أن طرق التفكك غير الأنزيمية القائمة على القوى الميكانيكية لكسر AT تضمن الحد الأدنى من التلاعب ، إلا أنه لا يمكن استخدام هذه الطرق إذا كان الهدف هو دراسة خلايا SVF ، حيث تتمتع بكفاءة أقل في استعادة الخلايا وقابلية بقاء منخفضة للخلايا مقارنة بالطرق الأنزيمية ، وهناك حاجة إلى حجم أكبر من الأنسجة 16,17. الهضم الأنزيمي باستخدام كولاجيناز هو طريقة لطيفة تسمح بالهضم الكافي للكولاجين وبروتينات المصفوفة خارج الخلية للأنسجة الليفية مثل WAT18 وكثيرا ما يستخدم عندما يكون التربسين غير فعال أو ضار19. يوفر البروتوكول إرشادات أساسية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للعزل الفعال للخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة وخلايا SVF من خزعات ضريبة القيمة المضافة البشرية في عملية واحدة ، باستخدام تقنية الهضم الأنزيمي كولاجيناز ، مما يعطي معلومات لضمان غلة عالية (الكمية والنقاء والسلامة) من إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا الشحمية الناضجة ، بما في ذلك microRNAs ، لتطبيقات التعبير النهائية. في الوقت نفسه ، تم تحسين البروتوكول لتحديد مجموعات فرعية من البلاعم من خلايا SVF من خلال تلطيخ علامات متعددة مرتبطة بالغشاء لمزيد من التحليل بواسطة قياس التدفقالخلوي 20.
تلعب ضريبة القيمة المضافة دورا مهما في تنظيم التمثيل الغذائي والالتهابات. أدى الاهتمام المتزايد بدور الخلايا الشحمية والخلايا المناعية في الالتهاب المزمن المرتبط بالسمنة إلى تطوير تقنيات مختلفة لفصل SVF والخلايا الدهنية الموجودة في AT. ومع ذلك ، فإن معظم التقنيات لا تسمح بالحصول على هاتين…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة من المعهد الوطني للطب البيريناتولوجي (أرقام المنح: 3300-11402-01-575-17 و 212250-3210-21002-06-15) و CONACyT ، الصندوق القطاعي للتحقيق في الصحة والأمن الاجتماعي (FOSISS) (رقم المنحة 2015-3-2-61661).
0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | – |
2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | – |
Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | – |
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
Baker | – | – | 250 ml, non sterile |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | – |
Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
Dissecting forceps | – | – | Steel, serrated jaws and round ends |
Dissection tray | – | – | Stainless steel |
Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | – |
FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | – |
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | – |
FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | – |
Manual cell counter | – | – | – |
Mayo dissecting scisors | – | – | Stainless steel |
Microcentrifuge | – | – | Adjustable temperature |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | – |
Orbital shaker | – | – | Adjustable temperature and speed |
P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | – |
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
Pipette controller | – | – | – |
Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
Refrigerated centrifuge | – | – | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
Sterile Specimen container | – | – | – |
Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
Tube racks | – | – | For different tube sizes |
Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | – |