Summary

Flusso di lavoro proteomica quantitativa senza etichette per interazioni host-patogeno guidate dalla scoperta

Published: October 20, 2020
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Summary

Qui, presentiamo un protocollo per profilare l’interazione tra ospite e agente patogeno durante l’infezione da proteomica a base di spettrometria di massa. Questo protocollo utilizza la quantificazione senza etichette per misurare i cambiamenti nell’abbondanza proteica sia dell’ospite (ad esempio, macrofagi) che dell’agente patogeno (ad esempio, Cryptococcus neoformans)in un singolo esperimento.

Abstract

I risultati tecnologici della proteomica quantitativa basata sulla spettrometria di massa (MS) aprono molte strade sconosciute per analizzare il proteoma globale di un organismo in condizioni variabili. Questa potente strategia applicata alle interazioni degli agenti patogeni microbici con l’ospite desiderato caratterizza in modo completo entrambe le prospettive verso l’infezione. Nel presente documento, il flusso di lavoro descrive la quantificazione senza etichette (LFQ) dell’infettivoma dei neoformani Cryptococcus, un agente patogeno intracellulare facultativo fungino che è l’agente causale della criptococcosi della malattia mortale, in presenza di cellule macrofagi immortalate. Il protocollo descrive in dettaglio le corrette tecniche di preparazione delle proteine sia per le cellule patogene che per le cellule di mammifero all’interno di un singolo esperimento, con conseguente adeguata sottomissione peptidica per l’analisi liquido-cromatografia (LC)-MS/MS. L’elevata produttività della natura generica dell’LFQ consente un’ampia gamma dinamica di identificazione e quantificazione delle proteine, nonché trasferibilità a qualsiasi impostazione di infezione patogena ospite, mantenendo un’estrema sensibilità. Il metodo è ottimizzato per catalogare ampi profili di abbondanza proteica imparziali di un agente patogeno in condizioni di imitazione delle infezioni. In particolare, il metodo qui dimostrato fornisce informazioni essenziali sulla patogenesi c. neoformans, come la produzione proteica necessaria per la virulenza e identifica le proteine ospiti critiche che rispondono all’invasione microbica.

Introduction

La prevalenza di infezioni fungine invasive è in costante aumento ed è correlata a tassi di mortalità inaccettabilmente elevati, più comunemente riportati in individui con predisposizioni immunodifese1. Cryptococcus neoformans è un noto agente patogeno fungino opportunistico in grado di sopravvivere intracellulare all’interno delle cellule macrofagi ospiti. Un intervento antimicotico inadeguato si traduce in diffusione fungina e manifestazioni potenzialmente letali di meningite criptococcica e meningoencefalite2,3. L’aumento globale dello status immunocomprotologico ha richiesto un parallelo aumento dell’uso di agenti antifungini, in cui molte specie fungine, tra cui c. neoformani, hanno sempre più evoluto la resistenza verso4,5,6. Pertanto, è imperativo implementare tecnologie solide ed efficienti per rispondere a domande biologiche vitali riguardanti la risposta alla difesa dell’ospite e la patogenesi microbica.

La nuova era del progresso tecnologico nella spettrometria di massa (SM), compresa la generazione di potenti condotte computazionali e bioinformatiche, fornisce le basi per una visione integrativa per l’analisi su larga scala della ricerca ospite-patogeno7,8. L’analisi proteomica convenzionale basata sulla patogenesi profila comunemente la vista dell’infezione dal punto di vista dell’ospite o dell’agente patogeno, incluse metodologie complete come il profilo di correlazione proteica, la cromatografia di affinità combinata con la proteomica e l’interaomica9. Le indagini sulla virulenza di agenti patogeni pericolosi in un sistema ospite sono di immensa importanza clinica; tuttavia, l’applicazione di un’analisi duale prospettica in un singolo esperimento era precedentemente considerata irraggiungibile. Ad esempio, la prospettiva dell’agente patogeno verso l’infezione è spesso sopraffatta da proteine ospiti altamente abbondanti con conseguente ridotta sensibilità per il rilevamento di proteine fungine a basso contenuto abbondante7. Inoltre, l’elevata complessità del campione invita molti obiettivi a indagare in un unico sistema sperimentale e si rivela difficile chiarire i meccanismi di azione per una specifica proteina patogena.

La proteomica bottom-up è una tecnica MS popolare che consente la preparazione gestibile del campione, in cui i peptidi sono generati dalla digestione enzimatica specifica della sequenza seguita dalla separazione, identificazione e quantificazione della cromatografia liquida da parte di MS10,11. Qui presentiamo un metodo che dimostra una strategia di acquisizione dipendente dai dati volta a ottenere una copertura imparziale di un proteoma o “infectome” basato sull’infezione. In particolare, la quantificazione senza etichette (LFQ) perde la dipendenza dalle etichette chimiche o metaboliche per un’identificazione robusta e accurata dei cambiamenti del livello proteico tra più proteomi, riducendo le fasi di manipolazione elavorazione del campione 12,13. Questa applicazione universale interroga le proteine prodotte in un dato momento all’interno di una cellula indipendente da qualsiasi produzione proteica prevista; pertanto, si possono scoprire nuove intuizioni che sono fondamentali per l’infezione.

Il flusso di lavoro descritto nel presente documento è ottimizzato per esplorare i cambiamenti a livello proteico dei neoformani C. durante le condizioni di imitazione delle infezioni con le cellule immunitarie ospiti (Figura 1). Piuttosto che basarsi sull’isolamento e la separazione dei tipi di cellule, questo approccio estrae insieme il proteoma ospite e patogeno e utilizza la separazione bioinformatica utilizzando due database specifici dell’organismo per distinguere la produzione proteica specifica delle specie. Questo metodo offre vantaggi per un numero illimitato di campioni da trattare senza le costose fasi di preparazione necessarie negli studi sull’etichettatura o nel frazionamento a base di isotopi. Inoltre, questo flusso di lavoro supporta protocolli di estrazione proteica ottimizzati trasferibili a una vasta gamma di agenti patogeni fungini e batterici in grado di colpire e infettare le cellule immunitarie ospiti. Nel complesso, questo protocollo delinea i passaggi per completare un’estrazione di proteine imparziali e l’elaborazione del campione per la SM ad alta risoluzione, seguita da dati e analisi statistiche, in grado di fornire una ricchezza di conoscenza delle proteine fungine significative per l’infezione combinate con una profilazione completa della risposta della difesa ospite.

Protocol

Una linea immortalata di macrofagi derivati dai topi BALB/c è stata utilizzata per il seguente protocollo approvato dal Protocollo 4193 dell’Università di Guelph Sull’Utilizzo degli Animali. In particolare, altri ceppi di topi o altre fonti di cellule immortalate possono essere applicati al protocollo delineato con test sufficienti per ottimizzare i parametri dettagliati. Il protocollo seguente consente di esplorare i passaggi che iniziano con una fiala bloccata di celle di macrofagi. Le cellule sono conservate in 10% …

Representative Results

Il protocollo sopra delineato consente l’identificazione e la quantificazione delle proteine derivate sia dall’agente patogeno fungino, C. neoformans, che dalle cellule di macrofagi ospiti, in un unico esperimento. Seguendo la cocoltura, le cellule vengono raccolte e lavorate insieme e separate bioinformaticamente in base a profili peptidici specifici di ciascuna specie. Questo è un approccio potente per definire l’interazione della relazione ospite-patogeno durante l’infezione. Il numero di proteine identifica…

Discussion

Le fasi critiche del protocollo includono la preparazione di cellule macrofagi e la raccolta di campioni di co-coltura per l’elaborazione delle proteine con un’interruzione minima delle cellule. È importante eseguire passaggi di lavaggio, inoculazione e rimozione delicata e attenta delle cellule macrofagi aderenti per prevenire l’analisi non necessaria delle cellule prima della raccolta. Stabilire il MOI corretto per l’esperimento è anche fondamentale in quanto l’inoculazione con un MOI eccessivamente elevato può caus…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano il Dr. Jonathan Krieger di Bioinformatics Solutions Inc. Gli autori riconoscono il sostegno al finanziamento, in parte, dalla Banting Research Foundation – The Jarislowsky Fellowship Discovery Award, New Frontiers Research Fund – Exploration (NFRFE-2019-00425), e dalla Canadian Foundation for Innovation (JELF 38798) per J.G.M., così come NSERC Canada Graduate Scholarship – Master and Ontario Graduate Scholarship for B.B., e Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology per A.S..

Materials

100 mM Tris-HCl, pH 8.5 Fisher Scientific BP152-1 Maintain at 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 174888
6-well cell culture plate ThermoFisher Scientific 140675
Acetonitrile, MS grade Pierce TS-51101
Acetic Acid Sigma Aldrich 1099510001
Acetone Sigma Aldrich 34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC) ThermoFisher Scientific A643-500 Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System Fisher Scientific 13-717-300 Not essential, serological pipettes can be used to remove media.
C18 resin 3M Empore 3M2215
Cell Scrapers VWR 10062-906 Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.
Centrifugal vaccuum concentrator Eppendorf 07-748-15
Complete Filtration Unit VWR 10040-436
Conical falcon tubes (15 mL) Fisher Scientific 05-539-12
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000 Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega G1780
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher Scientific R0861 Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 10566016
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific 12483020 Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation
Haemocytometer VWR 15170-208
HEPES Sigma Aldrich H3375 Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
High-performance liquid chromatography system ThermoFisher Scientific LC140 Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.
High-resolution mass spectrometer ThermoFisher Scientific 726042
Iodoacetamide (IAA) Sigma Aldrich I6125 Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
L-glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
LoBind Microcentrifuge tubes Eppendorf 13-698-794
MaxQuant https://maxquant.org/ MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets
Microcentrifuge Eppendorf 13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10k VWR CA12001-692 Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
Peptide separation columns ThermoFisher Scientific ES803
Perseus Software http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline VWR CA12001-676 Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.
Pierce BCA Protein Assay ThermoFisher Scientific  23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL) Fisher Scientific 13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix Fisher Scientific 14955235
Probe sonciator ThermoFisher Scientific 100-132-894
Protease inhibitor cocktail tablet Roche 4693159001
Sodium dodecyl sulfate ThermoFisher Scientific 28364 20% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop) ThermoFisher Scientific ND-2000
STAGE tipping centrifuge Sonation STC-V2
Thermal Shaker VWR NO89232-908
Trifluoroacetic acid ThermoFisher Scientific 85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade Pierce A40007 Maintain at -20 °C.
Ultrasonic bath Bransonic A89375-450 Stored in cold room (4C)
Urea Sigma Aldrich U1250-1KG Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
Yeast-extract peptone dextrose broth BD Difco BM20

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Cite This Article
Ball, B., Sukumaran, A., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (164), e61881, doi:10.3791/61881 (2020).

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