Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu küreseller üretmek ve yetiştirmek için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir kültür sistemi sunar. Sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere kanser kök hücre biyolojisini incelemek için bu yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.
Kolorektal kanserler heterojenlik ve tümör gelişimi, bakımı ve ilaçlara karşı dirençlerden sorumlu kanser kök hücre (CSC) popülasyonu içeren hiyerarşik bir organizasyon ile karakterizedir. Bu nedenle, CSC özelliklerinin spesifik hedeflemeleri için daha iyi anlaşılması, etkili tedavi için bir ön koşuldur. Bununla birlikte, derinlemesine incelemeler için uygun preklinik modellerin azlığı vardır. In vitro iki boyutlu (2D) kanser hücre hatları tümör biyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlasa da fenotipik ve genetik tümör heterojenliğini çoğaltmaz. Buna karşılık, üç boyutlu (3D) modeller fizyolojik kanser karmaşıklığına ve hücre heterojenliğine hitap ediyor ve yeniden üretiyor. Bu çalışmanın amacı, CSC biyolojisini incelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir 3D kültür sistemi tasarlamaktı. Mevcut metodoloji, uzun süreli kültür için kullanılabilecek bir model olan Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden homojen boyutta olan 3D küreseller üretmek için koşulların gelişimini ve optimizasyonunu açıklar. Daha da önemlisi, sferoidler içinde, lümen benzeri yapılar etrafında örgütlenen hücreler, diferansiyel hücre çoğalma paternleri ve bir işaret panelini ifade eden CSC’lerin varlığı ile karakterize edildi. Bu sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere hücre heterojenliğini ve CSC biyolojisini incelemek için bu 3D yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.
Kolorektal kanser (CRC) dünyada kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir1. CRC’nin gelişimi, onkogenlerin aktivasyonu ve tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu da dahil olmak üzere genetik mutasyonların ve / veya epigenetik değişikliklerin2,3,4’ünilerleyici bir edinimi ve birikmesinin sonucudur. Ayrıca, genetik olmayan faktörler (örneğin, mikroçevrim) onkojenik dönüşüme katkıda bulunabilir ve teşvik edebilir ve böylece CRC’lerin evrimine katılabilir5. Daha da önemlisi, CRC’ler, normal bir kolon mahzeninde epitelin organizasyonunu anımsatan hiyerarşik bir yapı oluşturan bazı farklılaşma özelliklerini gösteren farklı KSS’ler ve dökme tümör hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre popülasyonlarından oluşur6,7.
CSC’lerin tümör görünümü8, bakımı ve büyümesi, metastatik kapasitesi ve konvansiyonel tedavilere karşı direnci6,7’densorumlu olduğu düşünülmektedir. Tümörlerde, CSC’ler de dahil olmak üzere kanser hücreleri, belirgin mutasyonel ve epigenetik profilleri, morfolojik ve fenotipik farklılıkları, gen ekspresyasyonu, metabolizma, çoğalma oranları ve metastatik potansiyel açısından yüksek düzeyde heterojenlik ve karmaşıklık gösterir9. Bu nedenle, kanser biyolojisini, tümörün ilerlemesini ve tedaviye karşı direncin kazanılmasını ve etkili tedavilere çevrildiğini daha iyi anlamak için, bu kanser heterojenliğini ve hiyerarşisini yakalayan insan preklinik modelleri önemlidir10,11.
In vitro 2D kanser hücre hatları uzun süredir kullanılmaktadır ve tümör gelişimi ve terapötik moleküllerin etkinliğinin altında yer alan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır. Bununla birlikte, orijinal tümörlerde bulunan fenotipik ve genetik heterojenliğin eksikliği ile ilgili sınırlamaları artık yaygın olarak tanınmaktadır12. Ayrıca, besinler, oksijen, pH gradyanları ve tümör mikroçevrimi çoğaltılmamıştır, mikroçevrim özellikle CSC11,12dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin bakımı için önemlidir. Bu ana dezavantajların üstesinden gelmek için, kanserlerin karmaşıklığını ve heterojenliğini deneysel olarak ele almak ve çoğaltmak için birkaç 3D model geliştirilmiştir. Aslında, bu modeller vivo12 , 13,14’tegözlemlenenlere benzer şekilde tümör hücresel heterojenliği, hücre-hücre etkileşimlerini ve mekansal mimariyi rekapitulate eder. Taze tümörlerden kurulan primer tümör organoidleri ve hücre hattı kaynaklı küreseloidler büyük ölçüde 15,16’dır.
Küreseller, hücreleri hücre agregalarında oluşmaya ve büyümeye zorlamak için iskelesiz veya iskele tabanlı bir şekilde kültürlenebilir. İskelesiz yöntemler, yapışmayan koşullar altında hücrelerin kültürüne (örneğin, asma-bırakma yöntemi veya ultra düşük bağlanma plakaları) dayandırılırken, iskele bazlı modeller kültür hücrelerine doğal, sentetik veya hibrit biyomalzemelere dayanır12,13,14. İskele bazlı sferoidler, son küresel oluşum kullanılan (biyo)malzemenin doğasına ve bileşimine bağlı olacağından farklı dezavantajlar sunar. Şimdiye kadar mevcut olan iskelesiz küresel yöntemler substratın doğasına dayanmasa da, yapı ve boyut olarak değişen küreseller üretirler17,18.
Bu çalışma, CSC biyolojisini incelemek için Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden oluşan homojen boyutta olan sağlam ve tekrarlanabilir bir 3D kültür sistemi tasarlamayı amaçladı. Caco2 hücreleri, zaman içinde farklılaşma kapasiteleri nedeniyle özellikle ilgi çekicidir19,20, güçlü bir şekilde kök benzeri bir potansiyel önermektedir. Buna göre, küresellerin uzun süreli kültürü, kemoterapiye farklı yanıtlarla farklı CSC popülasyonlarının varlığını ortaya koydu.
In vitro 3D modeller, mikroçevrim ve hücre heterojenliği de dahil olmak üzere tipik tümöral özelliklerin yeniden kapsüllenmesinde daha güvenilir göründükleri için 2D kanser hücre kültürlerinin ana deneysel dezavantajlarının üstesinden gelmektedir. Yaygın olarak kullanılan 3D küresel modeller iskelesizdir (düşük ek koşullarında kültürlenir) veya iskele bazlıdır (kültür hücrelerine biyomalzemeler kullanılarak). Bu yöntemler, kullanılan iskelenin doğasına bağlı oldukları veya yapı …
The authors have nothing to disclose.
Görüntüleme ve Anipath recherche histoloji platformlarını (CRCL, CLB) kabul ediyoruz. FOLFOX ve FOLFIRI’nin nazik hediyesi için Centre Léon Bérard (CLB) Hastanesi eczanesine borçluyuz. Ayrıca brigitte manship’e makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Çalışma FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) ve Inca (PLBIO19-289) tarafından desteklendi. MVG ve LC FRM’den, CF ise ARC vakfından ve Centre Léon Bérard’dan destek aldı.
37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | – | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
Agarose | Sigma | A9539 | |
Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
Anti Caspase3 – Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
Anti Musashi-1 (14H1) – Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
Anti-CD133 (13A4) – Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
Anti-PCNA – Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
Anti-β-catenin – Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | – | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |