Preparación de inóculo enriquecido con virus para la infección oral de abejas melíferas (Apis mellifera)

Summary

Aquí describimos dos protocolos: primero para propagar, extraer, purificar y cuantificar grandes cantidades de partículas de virus no envueltas de abejas melíferas, incluido un método para eliminar las pupas de abejas melíferas y segundo para probar los efectos de la infección viral utilizando un bioensayo de jaula altamente repetible y de alto rendimiento.

Abstract

Las abejas melíferas son de gran importancia ecológica y agrícola en todo el mundo, pero también están sujetas a una variedad de presiones que afectan negativamente la salud de las abejas, incluida la exposición a patógenos virales. Tales virus pueden causar una amplia variedad de efectos devastadores y, a menudo, pueden ser difíciles de estudiar debido a múltiples factores que dificultan la separación de los efectos de los tratamientos experimentales de la infección de fondo preexistente. Aquí presentamos un método para producir en masa grandes cantidades de partículas de virus junto con un bioensayo de alto rendimiento para probar la infección viral y los efectos. Necesarias por la falta actual de una línea celular de abejas melíferas continua y libre de virus, las partículas virales se amplifican in vivo utilizando pupas de abejas melíferas, que se extraen de la colmena en grandes volúmenes utilizando una metodología mínimamente estresante. Estas partículas de virus se pueden usar en bioensayos de jaulas de abejas melíferas para probar la viabilidad de los inóculos, así como varias otras dinámicas de infección por virus, incluidas las interacciones con la nutrición, los pesticidas y otros patógenos. Una ventaja importante del uso de tales partículas es que reduce en gran medida las posibilidades de introducir variables desconocidas en la experimentación posterior en comparación con las alternativas actuales, como la infección a través de la hemolinfa de abeja infectada u homogeneización, aunque aún se debe tener cuidado al obtener las abejas, para minimizar la contaminación del virus de fondo. Los ensayos en jaulas no son un sustituto de los experimentos a gran escala y realistas en el campo que prueban los efectos de la infección por virus a nivel de colonia, sino que funcionan como un método para establecer respuestas virales de referencia que, en combinación con las partículas de virus semipuras, pueden servir como herramientas importantes para examinar varias dimensiones de las interacciones fisiológicas entre la abeja melífera y el virus.

Introduction

Las abejas melíferas (Apis mellifera) desempeñan un papel fundamental en el panorama agrícola mundial moderno, pero actualmente sufren de una combinación de factores estresantes bióticos y abióticos, incluida la exposición a pesticidas, forraje deficiente, parásitos y patógenos ^1,2. Uno de los patógenos más importantes de preocupación son los virus, muchos de los cuales son vectorizados por otro de los principales factores estresantes de las abejas melíferas, el ácaro parásito Varroa (Varroa destructor). Estos virus pueden causar una serie de efectos negativos en las abejas melíferas, incluida la reducción de la supervivencia de la cría, los defectos de desarrollo y la parálisis que pueden conducir al colapso total de la colmena tanto antes como después de los períodos de hibernación ^3,4,5. Aunque ha habido avances prometedores en el desarrollo de tecnologías utilizadas para combatir la infección por virus 6,7,8,9, la dinámica por la cual muchos virus se propagan, propagan e interactúan dentro de una abeja melífera o colonia aún no se conocen ^5,10 . Comprender la biología básica de las interacciones entre las abejas melíferas y los virus y sus relaciones con otros factores ambientales es fundamental para desarrollar técnicas efectivas de manejo de virus.

Sin embargo, el estudio de las interacciones entre la abeja melífera y el virus plantea desafíos con numerosos factores conocidos y desconocidos que complican el proceso. Estos incluyen interacciones con la dieta^11,12, exposición a pesticidas¹³ y antecedentes genéticos de^{abejas 14,15}. Incluso cuando se centra solo en la infección por virus, las complicaciones son comunes porque las poblaciones de abejas melíferas, tanto manejadas como silvestres, siempre tienen algún grado de infección por virus de fondo, aunque a menudo sin manifestar síntomas agudos ^16,17, y los efectos de la coinfección por virus no se comprenden bien¹⁸. Esto ha hecho que el estudio de los efectos del virus de la abeja melífera sea difícil de desentrañar.

Muchos estudios sobre el virus de las abejas melíferas han utilizado infecciones por virus circunstanciales para buscar interacciones con otros factores estresantes, observando cómo cambian las infecciones de fondo con otros tratamientos 12,19,20,21. Si bien este enfoque ha tenido éxito en la identificación de efectos importantes, especialmente al descubrir cómo los pesticidas o los tratamientos dietéticos afectan los niveles de virus y la replicación, la inoculación con un tratamiento de virus de contenido y concentración conocidos es fundamental para las pruebas experimentales de la dinámica de la infección por virus. Aun así, separar el tratamiento experimental de la infección de fondo también puede plantear desafíos. En estudios de campo, los investigadores han diferenciado cepas del virus del ala deformada (DWV) para proporcionar evidencia de la transmisión del virus de las abejas melíferas a los abejorros²², pero el uso de este enfoque sería difícil solo dentro de las abejas melíferas. Los clones infecciosos de virus son una herramienta poderosa, no solo para rastrear la infección 23,24,25, sino también para estudios de genética inversa de virus de abejas melíferas y para la investigación de la interacción virus-huésped 26,27,28. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los clones infecciosos todavía son necesarios para cumplir con el ciclo de infección dentro de las células para producir partículas. Tales partículas se prefieren como inóculo para tratamientos experimentales porque su infectividad es mayor que el ARN viral desnudo y la inoculación con genomas encapsidados imita una infección natural.

La producción de inóculos puros y no contaminados del virus de las abejas melíferas (cepas de virus de tipo silvestre o derivadas de clones infecciosos) también plantea desafíos. Estos se deben principalmente a las dificultades para obtener una línea celular de abeja melífera confiable, de replicación continua y libre de virus para producir virus de cepa pura^29,30. Si bien se han producido algunas líneas celulares, estos sistemas siguen siendo imperfectos; Aún así, existe la esperanza de que se pueda producir una línea celular viable²⁹, lo que permitiría un control más fino de la producción e investigación del virus. Hasta que dicha línea esté ampliamente disponible, la mayoría de los protocolos de producción de virus seguirán dependiendo del uso de la producción y purificación de virus in vivo 18,31,32,33,34. Estos enfoques implican identificar y purificar partículas de virus de interés (o producir un clon infeccioso) y usarlas para infectar a las abejas melíferas, generalmente como pupas. Las pupas se inyectan con el virus objetivo y luego se sacrifican, y se extraen y purifican más partículas. Sin embargo, debido a que ninguna abeja está libre de virus para empezar, siempre hay algún grado de contaminación por rastros de otros virus en cualquier concentrado de este tipo y, por lo tanto, se debe tener mucho cuidado al elegir abejas con una baja probabilidad de infecciones de fondo. Además, los métodos para eliminar las pupas de las células del peine para su uso en estos protocolos³³ son muy laboriosos y pueden inducir estrés en las abejas, limitando la producción por estos medios^18,32. Aquí, informamos un método alternativo que permite la eliminación a gran escala de larvas con poca mano de obra y menos estrés mecánico en las abejas.

Una vez que se obtienen las pupas y se inyectan con el inóculo del virus inicial, deben incubarse para proporcionar tiempo al virus para replicarse. Posteriormente, las partículas de virus producidas pueden procesarse en una forma utilizable para infectar abejas experimentales. Existen varios métodos simples para lograr esto, incluido el uso de un homogeneizado crudo^35,36 o hemolinfa generada a partir de abejas infectadas viralmente como fuente de infección³⁷. Estos métodos son efectivos, pero tienen una mayor probabilidad de introducir variables desconocidas del sustrato de fondo (por ejemplo, otros factores en los homogeneizados de las abejas muertas). Además, es deseable concentrar las partículas si un experimento requiere administrar una dosis grande y conocida de un virus en un corto período de tiempo. Por lo tanto, para un mejor control, es preferible utilizar métodos que permitan cierto nivel de purificación y concentración de las partículas del virus. En general, una serie de pasos de precipitación y centrifugación darán como resultado la eliminación de casi todo el posible material de virus no objetivo³³.

Después de producir este inóculo concentrado, es beneficioso cuantificar los títulos virales (qPCR) y caracterizarlo con bioensayos in vivo para probar su viabilidad y capacidad de causar mortalidad, así como para corroborar que se obtienen títulos de virus aumentados después de la infección. Esto se puede lograr a través de experimentos de inyección (ya sea en pupas o adultos) o experimentos de alimentación (en larvas o adultos). Si bien todos estos enfoques son posibles, alimentar a grupos de abejas adultas en una jaula es a menudo lo más rápido y simple. El método de ensayo de jaula también se usa ampliamente para probar varios otros tratamientos en abejas, incluida la toxicidad por pesticidas³⁸, el desarrollo de^{ovarios 39} y la influencia nutricional en el comportamiento^40,41 y, por lo tanto, puede formar una buena base para experimentos que vinculan la infección por virus con otros factores⁴².

Aquí describimos un método confiable para producir grandes cantidades de partículas de virus semipuras y altamente enriquecidas sin usar una costosa ultracentrífuga, incluido un método para eliminar pupas que reduce el trabajo de parto y el estrés mecánico en las abejas y un bioensayo altamente repetible y de alto rendimiento para probar la infección viral y los efectos. Al controlar estrechamente la pureza del inóculo viral, los investigadores pueden reducir la variación en la respuesta viral de las abejas melíferas en relación con otros métodos de inoculación viral. Además, el bioensayo puede detectar efectos virales a nivel de grupos pequeños utilizando unidades experimentales altamente repetibles antes de escalar a entornos realistas de campo, lo que es mucho más laborioso de manejar. En combinación, estos dos métodos proporcionan las herramientas necesarias para los estudios que pueden ayudar a mejorar nuestra comprensión general de las interacciones fisiológicas entre las abejas melíferas y los virus.

Protocol

1. Opción de extracción masiva de abejas 1: autoeliminación de larvas Enjaula a una reina abeja melífera en un marco langstroth vacío y prolongado y devuélvela a su colonia. Deje que la reina ponga huevos en este marco durante 24 h. Revise el marco después de 24 h para asegurarse de que la mayoría de las células del peine contengan huevos recién puestos. Dependiendo de la reina y la colonia, los huevos a veces no se ponen muy bien en las primeras 24 h. Si esto ocurre, espere 24 horas adicional…

Representative Results

Seguir con éxito los protocolos (Figuras 1) para la inyección de pupas y la extracción viral debe producir grandes cantidades de partículas de virus. Sin embargo, el muestreo y la inyección de pupas procedentes de una variedad de colonias en múltiples puntos de tiempo maximiza las posibilidades de adquirir el virus objetivo con baja contaminación. La dinámica por la cual los virus se replican e interactúan entre sí dentro de una abeja melífera no se entiende bien; junto con la probabilidad de …

Discussion

Aquí hemos esbozado métodos que detallan cada paso del proceso de amplificación del virus y preparación de la población de inóculos, incluida la recolección de larvas y la propagación, extracción y concentración del virus, así como el tratamiento viral en forma de experimentos de alimentación en jaulas. Estos métodos permiten la producción de partículas de virus semipuras (Figura 4), cuya eficacia puede cuantificarse consistentemente mediante pruebas de mortalidad dosis-respue…

Materials

10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375