Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera)

Summary

Aqui descrevemos dois protocolos: primeiro para propagar, extrair, purificar e quantificar grandes quantidades de partículas de vírus não envoltas em abelhas, incluindo um método para remover pupas de abelha mel e segundo para testar os efeitos da infecção viral usando um bioensaão de gaiola altamente repetigível e de alto rendimento.

Abstract

As abelhas são de grande importância ecológica e agrícola em todo o mundo, mas também estão sujeitas a uma variedade de pressões que afetam negativamente a saúde das abelhas, incluindo a exposição a patógenos virais. Esses vírus podem causar uma grande variedade de efeitos devastadores e muitas vezes podem ser desafiadores para estudar devido a múltiplos fatores que dificultam a separação dos efeitos dos tratamentos experimentais da infecção de fundo pré-existente. Aqui apresentamos um método para produzir em massa grandes quantidades de partículas de vírus, juntamente com um bioensaio de alto rendimento para testar infecções e efeitos virais. Necessitadas pela atual falta de uma linha celular de abelhas de mel contínua e livre de vírus, as partículas virais são amplificadas in vivo usando pupas de abelha mel, que são extraídas da colmeia em grandes volumes usando metodologia minimamente estressante. Essas partículas de vírus podem então ser usadas em bioensações de gaiolas de abelhas para testar a viabilidade do inocula, bem como várias outras dinâmicas de infecção por vírus, incluindo interações com nutrição, pesticidas e outros patógenos. Uma grande vantagem do uso dessas partículas é que ela reduz consideravelmente as chances de introduzir variáveis desconhecidas na experimentação subsequente quando comparadas às alternativas atuais, como infecção por hemoglifo de abelha infectada ou homogeneização, embora ainda deva ser tomado cuidado ao fornecer as abelhas, para minimizar a contaminação do vírus de fundo. Os ensaios da gaiola não substituem experimentos realistas em larga escala que testam efeitos de infecção por vírus em nível de colônia, mas funcionam como um método para estabelecer respostas virais de linha de base que, em combinação com as partículas de vírus semi-puros, podem servir como ferramentas importantes para examinar várias dimensões das interações fisiológicas do vírus das abelhas.

Introduction

As abelhas de mel (Apis mellifera) desempenham um papel crítico na paisagem agrícola global moderna, mas atualmente sofrem de uma combinação de estressores bióticos e abióticos, incluindo exposição a pesticidas, forragem ruim, parasitas e patógenos ^1,2. Um dos patógenos mais importantes de preocupação são os vírus, muitos dos quais são vetoriados por outro dos maiores estressores de abelhas, o ácaro varroa parasita (destruidor varroa). Esses vírus podem causar uma série de efeitos negativos nas abelhas, incluindo a redução da sobrevida da ninhada, defeitos de desenvolvimento e paralisia que podem levar ao colapso total da colmeia antes e depois do overwintering^{períodos 3,4,5}. Embora tenha havido avanços promissores no desenvolvimento de tecnologias usadas para combater a infecção pelo vírus 6,7,8,9, a dinâmica pela qual muitos vírus se propagam, se espalham e interagem dentro de uma abelha ou colônia ainda são mal compreendidas ^5,10 . Compreender a biologia básica das interações entre abelhas e vírus e suas relações com outros fatores ambientais é fundamental para o desenvolvimento de técnicas eficazes de manejo de vírus.

No entanto, estudar as interações mel-vírus representa desafios com inúmeros fatores conhecidos e desconhecidos que complicam o processo. Estes incluem interações com a dieta^11,12, exposição a pesticidas¹³ e fundo genético de abelhas^14,15. Mesmo focando apenas na infecção por vírus, complicações são comuns porque as populações de abelhas de mel, tanto controladas quanto selvagens, sempre têm algum grau de infecção por vírus de fundo, embora muitas vezes sem manifestar sintomas agudos^16,17, e os efeitos da coinfecção do vírus não são bem compreendidos¹⁸. Isso tornou difícil o estudo dos efeitos do vírus das abelhas.

Muitos estudos sobre o vírus das abelhas têm usado infecções circunstanciais do vírus para procurar interações com outros estressores, observando como as infecções de fundo mudam com outros tratamentos 12,19,20,21. Embora essa abordagem tenha sido bem sucedida na identificação de efeitos importantes, especialmente descobrindo como os tratamentos pesticidas ou dietéticos afetam os níveis e a replicação do vírus, a inoculação com um tratamento de vírus de conteúdo e concentração conhecidos é fundamental para testes experimentais da dinâmica da infecção por vírus. Mesmo assim, separar o tratamento experimental da infecção em segundo plano também pode representar desafios. Em estudos de campo, pesquisadores têm cepas diferenciadas de vírus de asa deformada (DWV) para fornecer evidências para a transmissão de vírus de abelhas de mel para abelhas²², mas usar essa abordagem seria difícil apenas dentro das abelhas. Clones infecciosos de vírus são uma ferramenta poderosa, não apenas para rastrear infecções 23,24,25, mas para estudos de genética reversa de vírus de abelhas de mel e para pesquisas de interação entre vírus e hospedeiros 26,27,28. No entanto, na maioria dos casos, clones infecciosos ainda são necessários para cumprir o ciclo de infecção dentro das células para produzir partículas. Tais partículas são preferidas como inocula para tratamentos experimentais porque sua infectividade é maior do que o RNA viral nu e a inoculação com genomas encapsidados imita uma infecção natural.

A produção de inocula de vírus de abelhas de mel puro e não contaminado (cepas de vírus do tipo selvagem ou aquelas derivadas de clones infecciosos) também representam desafios. Estes se devem principalmente às dificuldades em obter uma linha de células de abelhas de mel confiável, continuamente replicante e livre de vírus para produzir vírus de cepa pura^29,30. Embora algumas linhas celulares tenham sido produzidas, esses sistemas permanecem imperfeitos; ainda assim, há esperança de que uma linha celular viável possa ser produzida²⁹, o que permitiria um controle mais fino da produção e investigação do vírus. Até que essa linha se torne amplamente disponível, a maioria dos protocolos de produção de vírus continuará a depender do uso do vírus in vivo e da purificação 18,31,32,33,34. Essas abordagens envolvem identificar e purificar partículas de vírus de interesse (ou produzir um clone infeccioso) e usá-las para infectar abelhas, geralmente como pupas. As pupas são injetadas com o vírus alvo e depois sacrificadas, e outras partículas são extraídas e purificadas. No entanto, como nenhuma abelha é livre de vírus para começar, há sempre algum grau de contaminação por vestígios de outros vírus em qualquer concentrado, e, portanto, deve-se tomar muito cuidado na escolha de abelhas com baixa probabilidade de infecções de fundo. Além disso, os métodos de remoção da pupae das células pente-pente para uso nesses protocolos³³ são muito trabalhosos e podem induzir o estresse nas abelhas, limitando a produção por esses meios ^18,32. Aqui, relatamos um método alternativo que permite a remoção em larga escala de larvas com pouco trabalho de parto e menos estresse mecânico nas abelhas.

Uma vez que as pupas são obtidas e injetadas com o vírus inicial inóculo, elas devem ser incubadas para fornecer tempo para o vírus se replicar. Posteriormente, partículas de vírus produzidas podem ser processadas em uma forma utilizável para infectar abelhas experimentais. Existem vários métodos simples para conseguir isso, incluindo o uso de um homogene^{mente bruta 35,36} ou hemoglifo gerado a partir de abelhas viralmente infectadas como fonte de infecção³⁷. Esses métodos são eficazes, mas têm maior chance de introduzir variáveis desconhecidas do substrato de fundo (por exemplo, outros fatores nos homogeneizadores de abelhas mortas). Além disso, é desejável concentrar as partículas se um experimento requer dar uma grande dose conhecida de um vírus em um curto período de tempo. Portanto, para um melhor controle, é preferível usar métodos que permitam algum nível de purificação e concentração das partículas do vírus. Geralmente, uma série de etapas de precipitação e centrifugação resultarão na remoção de quase todos os possíveis materiais^{não-alvos do vírus 33}.

Após produzir esse inóculo concentrado, é benéfico quantificar os títulos virais (qPCR) e caracterizá-lo com bioensações in vivo para testar sua viabilidade e capacidade de causar mortalidade, bem como corroborar que o aumento dos do vírus são obtidos após a infecção. Isso pode ser alcançado através de experimentos de injeção (seja em pupas ou adultos) ou experimentos de alimentação (em larvas ou adultos). Embora todas essas abordagens sejam possíveis, alimentar-se de grupos de abelhas adultas em uma gaiola é muitas vezes o mais rápido e simples. O método de ensaio da gaiola também é amplamente utilizado para testar vários outros tratamentos sobre abelhas, incluindo toxicidade de pesticidas³⁸, desenvolvimento de ovário³⁹ e influência nutricional no comportamento^40,41 e, portanto, pode formar uma boa base para experimentos que ligam a infecção pelo vírus a outros fatores⁴².

Aqui descrevemos um método confiável para produzir grandes quantidades de partículas de vírus semi-puras e altamente enriquecidas sem o uso de uma ultracentrifuagem cara, incluindo um método para remover pupas que reduz o trabalho e o estresse mecânico nas abelhas e um bioensato altamente repetitivo e de alto rendimento para testar infecções e efeitos virais. Controlando firmemente a pureza do inocula viral, os pesquisadores são capazes de reduzir a variação da resposta viral das abelhas em relação a outros métodos de inoculação viral. Além disso, o bioensativo pode testar efeitos virais em um nível de pequenos grupos usando unidades experimentais altamente repetíveis antes de escalar para configurações realistas de campo, o que é muito mais trabalhoso para gerenciar. Em combinação, esses dois métodos fornecem as ferramentas necessárias para estudos que podem ajudar a melhorar nossa compreensão geral das interações fisiológicas do vírus das abelhas.

Protocol

1. Opção de extração de abelhas em massa 1: auto-remoção larval Gaiola uma rainha das abelhas em um quadro vazio e desenhado langstroth e devolvê-la para sua colônia. Deixe a rainha colocar ovos neste quadro por 24 horas. Verifique o quadro após 24 horas para garantir que a maioria das células do pente contenha ovos recém-colocados. Dependendo da rainha e da colônia, os ovos às vezes não são colocados muito bem nas primeiras 24 horas. Se isso ocorrer, permita um adicional de 24 horas e aj…

Representative Results

Seguindo com sucesso os protocolos (Figuras 1) para injeção de pupal e extração viral devem produzir grandes quantidades de partículas de vírus. No entanto, a amostragem e a injeção de pupas provenientes de uma variedade de colônias em vários pontos de tempo maximiza as chances de adquirir vírus alvo com baixa contaminação. A dinâmica pela qual os vírus se replicam e interagem entre si dentro de uma abelha não é bem compreendida; juntamente com a probabilidade de infecção pré-existent…

Discussion

Aqui delineamos métodos detalhando cada etapa do processo de amplificação do vírus e preparação do estoque inóculo, incluindo coleta de larvas e propagação de vírus, extração e concentração, bem como tratamento viral na forma de experimentos de alimentação de gaiolas. Esses métodos permitem a produção de partículas de vírus semi-puros (Figura 4), da qual a eficácia pode ser quantificada consistentemente por testes de mortalidade por dose-resposta para vírus letais para…

Materials

10% bleach solution
24:1 chloroform:isoamyl alcohol	SigmaAldrich	C0549
70% ethanol solution
Cages for bioassay			Dependent on experimental setup
Combitips Advanced 0.1 mL	Eppendorf	30089405	Optional (if no injector appartus is available)
Containers for larval self-removal			Should measure roughly 19" x 9-1/8" (Langstroth deep frame dimensions)
Forceps			Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision
Fume hood
Incubator			Capable of maintaining 34 ºC and 50% relative humidity
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Any absorbent wipe will work
Medium-sized weight boats			Serve as inoculum trays
Microcon-100kDa with Biomax membrane	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitrile gloves
Phosphate buffered saline (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Refrigerated benchtop centrifuge			Capable of 15,000 x g
Refrigerated centrifuge			Capable of 21,000 x g
Repeater M4 Multipipette	Eppendorf	4982000322	Optional (if no injector appartus is available)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-free water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375