פרוטוקול זה מספק הליך מקיף כדי ליצור אורגנואיד עצב מוטורי iPS האנושי נגזר באמצעות הרכבה ספונטנית של חבילה חזקה של אקסונים המורחבת מספרואיד בשבב תרבית רקמות.
צואה של אקסונים היא אחד המוטיבים המבניים העיקריים שנצפו במערכת העצבים. שיבוש של fascicles אקסון יכול לגרום למחלות התפתחותיות ונוירודגנרטיביות. למרות מחקרים רבים של אקסונים נערכו, ההבנה שלנו של היווצרות ותפקוד לקוי של fascicles אקסון עדיין מוגבל בשל היעדר מודלים תלת מימדיים חזקים במבחנה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לדור המהיר של אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPS) הנגרמים על ידי בני אדם בשבב תרבות רקמות מבוסס מיקרופלואידי. ראשית, ייצור שבבים המשמשים לשיטה מתואר. מתאי iPS אנושיים, נוצר ספרואיד נוירון מוטורי (MNS). לאחר מכן, מערכת ה-MNS המבודלת מועברת לשבב. לאחר מכן, האקסונים גדלים באופן ספונטני מתוך הכדורית ומתכנסים לתוך שקע בתוך מיקרו-שנל המצויד בשבב, אשר מייצר רקמת MNO הנושאת צרור של אקסונים המורחבים מהספרואיד. לניתוח במורד הזרם, ניתן להוציא MNOs מהשבב כדי להיות קבוע לניתוחים מורפולוגיים או לנתח ניתוחים ביוכימיים, כמו גם הדמיית סידן והקלטות מערך רב אלקטרודות. MNOs שנוצר עם פרוטוקול זה יכול להקל על בדיקות סמים סינון והוא יכול לתרום להבנת מנגנונים הבסיסית פיתוח ומחלות של fascicles אקסון.
נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה (MN) מרחיבים את האקסונים לשרירי השלד כדי לשלוט בתנועת הגוף. המסלולים האקסונליים שלהם מאורגנים ומוסדרים מאוד בתהליך ההתפתחותי. למרות מחקרים רבים על הארכת אקסון והדרכה1, מנגנונים להיווצרות צרור אקסון מאורגן עדיין תחת חקירה. אקסונים של נוירונים מוטוריים נפגעים לעתים קרובות על ידי מחלות ניווניות כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS)2, אבל מנגנונים פתופיזיולוגיים של הנזק על fascicles אקסון מובנים היטב. לפיכך, מודל פיזיולוגי ופתולוגי לסיכום היווצרות צרור אקסון ורגרסיה נדרש בתחום.
נוירון מוטורי שמקורו בתאי גזע אנושיים הוא פלטפורמה מבטיחה להבנת ההתפתחות והמחלות כגון ALS3. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (תאי iPS) יכולים לשמש למודל מחלות באמצעות תאים שמקורם בחולה. עד כה, שיטות בידול שונות מתאי גזע פלוריפוטנטיים לתוך MN דווחו4,5,6. עם זאת, אקסונים של נוירונים בתרבות דו מימדית מכוונים באופן אקראי ואינם מסכמים מחדש במיקרו-ווירון vivo בתוך עצבים מתפתחים שבהם אקסונים מורכבים באופן חד כיווני באמצעות אינטראקציות אקסו-אקסונליות צפופות7. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו טכניקה ליצירת רקמה תלת מימדית הדומה לעצב מוטורי מתאי iPS אנושיים8, וקראנו לרקמה אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO). MNO מורכב מגופי תאים הממוקמים בספרואיד נוירון מוטורי (MNS) ו fascicle אקסונלי המורחבת מן הכדוריד. האקסונים ב fascicle הם בעלי אוריינטציה חד כיוונית, אשר דומה אקסונים בפיתוח עצבים מוטוריים. לפיכך, MNOs באופן ייחודי לספק microenvironment אקסונלי פיזיולוגי, אשר לא נעשה על ידי כל שיטות אחרות שפותחו בעבר תרבות עצבית.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לייצור שבבי תרבית רקמות, התמיינות נוירון מוטורי מהירה, היווצרות אורגנואיד עצב מוטורי בשבבים מפותחים. שבב תרבית הרקמות שלנו הוא פשוט מאוד, והוא מכיל רק תא לקבלת ספרואיד, מיקרו-שאנל ליצירת צרור אקסון, ותא לדיור מסופי אקסון. המכשיר אינו מכיל מבנים מורכבים כולל microgrooves או מסנני micropore המשמשים לעתיםקרובותכדי להפריד אקסונים וגופי תאים לפי גודל 9,10. לפיכך המכשירים שלנו ניתן לפברק בקלות על ידי ביצוע השלבים המתוארים בפרוטוקול זה אם הגדרת פוטוליטוגרפיה זמין.
בידול מהיר של תאי iPS אנושיים מושגת עם שילוב ממוטב של גורמי גרימת ודוגמת (SB431542, LDN-193189, חומצה רטינואית (RA), אגוניסט החלקה (SAG)) וגורמי תאוצה (SU5402 ו- DAPT). דווח כי השילוב של SU5402 ו- DAPT מאיץ את הבידול של נוירונים היקפיים ותאי ציצה עצביים11. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שלוש שיטות שונות ליצירת MNOs, כך שהקוראים יוכלו להחליט על שיטה המתאימה ביותר לצרכיהם. אנו ממליצים לבצע בידול של תאי iPS אנושיים לאחר יצירת ספרואיד (שיטת 3D), שכן MNS מובחן יכול להיות מועבר ישירות לתוך שבב תרבית רקמה. לחלופין, תאי iPS אנושיים יכולים להיות מובחנים לתוך נוירונים מוטוריים בתרבות monolayer (2D), ולאחר מכן נוצר לתוך כדורי נוירון מוטורי תלת מימדי כפי שדיווחנו בעבר8. עדכנו את הפרוטוקול, ועם שיטת הבידול התלת מימדית המתוארת בפרוטוקול זה, ניתן להימנע מהמעבר מד”ד לתלת-ממד וניתן להשיג MNOs עם זמן בידול קצר יותר, פחות שלבים וסיכונים טכניים מופחתים ללא שלב הניתוק. נוירונים זמינים מסחרית יכולים לשמש גם כדי ליצור MNS כדי להפחית את הזמן עבור בידול.
כדי ליצור MNO, אנחנו תרבותיים MNS בשבב תרבות הרקמות. האקסונים מתעלים מהספרואיד ומתרחבים למיקרו-שנל שבו האקסונים מתאספים ומתיישרים באופן חד-כיווני. זה מקל על אינטראקציה אקסו-אקסונלית והיווצרות ספונטנית של רקמת צרור חד כיוונית מורכבת היטב של אקסונים במיקרו-שאנל, אשר מושגת באופן ייחודי על ידי פרוטוקול זה, ואילו היווצרות צרור ספונטני או אוריינטציה אקסונית מודרכת לבדה יכולה להיות מושגת על ידי פרוטוקולים אחרים12,13,14. בניסוי טיפוסי, תאים מעטים נודדים מספרואידים למיקרו-שנל ורוב התאים נשארים ספרואידים סמוכים. שיטה זו מאפשרת להפריד אקסונים באופן ספונטני מהספרואידים מבלי להשתמש במחסומים פיזיים תלויי גודל (למשל, מיקרוגרובים או מסנני מיקרופור) כדי להפריד אקסונים מגופי תאים.
MNO וכתוצאה מכך יכול להיות נתון לבדיקות שונות, כולל ניתוחים מורפולוגיים, ביוכימיים ופיזיים. גוף התא וחבילת האקסון המורחבת יכולים להיות מבודדים פיזית על ידי חיתוך וניתן לנתח אותם בנפרד לניסויים במורד הזרם, למשל, מבחנים ביוכימיים. חומרים ביולוגיים כולל RNA וחלבון ניתן לבודד רק כמה חבילות אקסון עבור מבחנים ביוכימיים רגילים כולל RT-PCR ו סופג המערבי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואיד עצבי מוטורי מתאי iPS, המציע מודל פיזיולוגי ופתולוגי אטרקטיבי לחקר המנגנון שבבסיס ההתפתחות והמחלה של שרירי האקסון.
פרוטוקול זה מתאר היווצרות של אורגנואיד עצב מוטורי (MNO) אשר יש צרור אקסון המורחבת מספרואיד נוירון מוטורי שנוצר מתאי iPS אנושיים. צרור האקסון שנוצר הוא עבה, גמיש ומאורגן היטב במבנים חד-כיווניים. על ידי ניתוח צרור האקסון, ניתן להשיג חלבון אקסונלי ו- RNA בטוהר גבוה מספיק לניתוחים ביוכימיים. פעילות עצבית ניתן למדוד בחבילות אקסון וספרואידים עם הדמיית סידן. זיהום של חלבונים גרעיניים ודנדריטיים בליסט האקסונלי לא זוהה על ידי סופג מערבי, והוכיח שהשיטה שלנו הפרידה ביעילות אקסונים מגופי תאים ודנדריטים.
אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא בידול מהיר ויצירת MNO מצויד צרור אקסון, שבו כל התהליכים יכולים להיעשות ב 4 שבועות עם פרוטוקול 3D ו 5-6 שבועות באמצעות פרוטוקול 2D. זה קצר בהשוואה לפרוטוקולים אחרים אשר בדרך כלל לקחת 3-4 שבועות פשוט להבדיל לתוך MN מתאי גזע עובריים ותאי iPS17 וזה לוקח 2-4 שבועות נוספים כדי לקבל התארכות אקסון. פרוטוקול תלת-ממד מועדף בדרך כלל על-פני פרוטוקול דו-ממדי בשל זמן הבידול הקצר יותר, פחות שלבים והסיכונים הטכניים המופחתים ללא שלב הניתוק בהשוואה לפרוטוקול הדו-ממדי. שבב תרבות הרקמה המבוסס על מיקרופלואידים תוכנן באופן כך שהאקסונים של MNS יוכלו להאריך לכיוון התא השני דרך המיקרו-שאנל, המאפשר היווצרות צרור של אקסונים על ידי גרימת אינטראקציות אקסו-אקסונליות וזיקה בין אקסונים. בגלל ההגדרה הניסיונית הפשוטה, כל הפרוטוקולים המתוארים כאן יכולים להתבצע לא רק על ידי ביו-הנדסה, המכירים את המניפולציה של שבב תרבות רקמות, אלא גם ביולוגים וחוקרי מוח שאינם מכירים מיקרופלואידים וטכניקות מיקרו-פיבריקציה. יש לציין כי שלבים 1 ו- 2 יכולים להתבצע גם באמצעות שירות ייצור חיצוני.
אחד הצעדים הקריטיים להשגת הפרוטוקול הוא שינוי רציף של מדיום תרבותי. מומלץ לשנות לחלוטין את מדיום התרבות בכל שלב במהלך הבידול, כך שגורמים במדיום המושקע לא יפריעו לבידול MN. נקודה קריטית נוספת של פרוטוקול זה היא לשמור על תאי iPS מובחנים באיכות טובה. איכות תרבות התאים הראשונית של iPS משפיעה באופן משמעותי על היעילות להשגת נוירונים מוטוריים ו- MNO. נקודה נוספת היא כי הקוטר של MNS צריך להיות קטן יותר מגודל החור של השבב (1.5 מ”מ). ספרואידים גדולים יותר אינם יכולים להיכנס לתא, ועלולים לחוות נמק היפוקסי חמור בחלק המרכזי. ניתן לשלוט בגודל של MNSs על ידי שינוי מספר זריעה ראשוני של תאי iPS (בפרוטוקול 3D) או נוירונים מוטוריים (בפרוטוקול דו-ממדי). יש למטב את צפיפות הזריעה של תאים עבור כל קו תא iPS.
מכשירים מיקרופלואידיים ממודרים עם מיקרוגרובים ומסנני נקבוביות קטנים שימשו באופן נרחב להפרדת אקסונים מגופי תאים ודנדריטים. טכניקה זו יכולה גם להפריד אקסונים מגופי תאים ודנדריט, עם שפע מעולה של אקסונים ברקמות ארוזות. בהשוואה לשיטות אחרות, מגבלה מרכזית אחת של שיטה זו היא שהיא אינה יכולה להפריד בין שתי מדיה תרבותית שונה בעיצוב הנוכחי של שבב תרבות הרקמה, המעכב את היכולת של תרבות משותפת של שני תאים שונים הדורשים שתי מדיה נפרדת. מגבלה נוספת היא כי שבב PDMS לשים הגבלה קבועה מראש על גודל הרקמה. ספרואיד גדול יותר מהחור לא יכול להיכנס לתא, וחבילת האקסון לא יכולה להיות עבה יותר מרוחב הערוץ המיקרופלואידי.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים אחרים של נוירונים. הקבוצה שלנו הראתה יכולת מודל של מערכת מוחית באמצעות שיטה שונה בשילוב עם טכניקות אורגנואיד מוחי18. ספירואידים קליפת המוח הוכנסו לשני התאים והאקסונים התארכו באופן ספונטני הדדית לכיוון כל ספרואיד, ולאחר מכן צרור אקסון נוצר באופן ספונטני. כתוצאה מכך, ניתן לחבר שני כדוריות קליפת המוח באמצעות צרור אקסון, ואת הרקמה ניתן להשיג כחתיכה אחת. זה מדגים כי הגישה היא מאוד תכליתי כדי ליצור רקמות צרור אקסון ללא קשר לסוגי תאים עצביים. בפרוטוקול זה, תאי iPS אנושיים שימשו, עם זאת, תאי גזע אחרים כולל תאי ES אנושיים ותאי גזע עצביים אנושיים עשויים לשמש עם שינויים בפרוטוקול המוצג. 3D spheroids של נוירונים יכול להיווצר על ידי פרוטוקולים מגוונים19,20. שיטה זו של ביצוע רקמות עם צרור אקסון יכול להיות משולב בעתיד עם פרוטוקולי בידול אחרים להכנת כדורי MN 3D. בנוסף, עובי ואורך צרור האקסון ניתן לשלוט פשוט על ידי שינוי הרוחב והגובה של microchannels של שבב תרבות הרקמה להתפתחויות עתידיות.
אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לשמש בדיקות סמים סינון והוא יכול לתרום להבנת מנגנונים שבבסיס הפיתוח והמחלות של fascicles אקסון.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענקים בסיוע למחקר מדעי 17H05661 ו 18K19903, Core-2-core תוכנית, ומעבר AI המכון.
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
Accutase | ICT | AT104 | |
B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
DAPT | Sigma | D5942 | |
DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
HBSS | Wako | 085-09355 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
SAG | Sigma | SML1314 | |
SB431542 | Wako | 192-16541 | |
Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
SU5402 | Sigma | SML0443 | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
Y-27632 | Wako | 030-24021 |