Summary

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

Published: August 06, 2020
doi:

Summary

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הוראה כיצד למדוד את היכולת של נוגדנים הנוכחי סרה או פלזמה של אנשים, באופן טבעי חשוף Plasmodium זיהום falciparum, כדי opsonize ו לגרום phagocytosis של אריתרוציטים נגועים טפילים (IEs).

Abstract

הפרוטוקול מתאר כיצד להגדיר ולהפעיל זרימה ציטומטריה מבוססי phagocytosis אסייג של Plasmodium falciparum-נגוע אריתרוציטים (IEs) opsonized על ידי נוגדנים IgG שנרכשו באופן טבעי ספציפי עבור VAR2CSA. VAR2CSA הוא אנטיגן טפיל המתווכת את ההפרדה הסלקטיבית של IEs שליה שיכול לגרום לצורה חמורה של מלריה בנשים בהריון, הנקרא מלריה שליה (PM). הגנה מפני PM מתווך על ידי נוגדנים ספציפיים VAR2CSA כי הם האמינו לתפקד על ידי עיכוב ההשתה שליה ו / או על ידי opsonizing IEs עבור phagocytosis. ה-assay משתמש IEs בשלב מאוחר מסונכרן in vitro שנבחרו במבחנה לבטא VAR2CSA, פלזמה / סרום-נוגדנים מנשים עם חסינות ספציפית PM שנרכש באופן טבעי, ואת קו התא הפוגוציצי THP-1. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לומר את הפונקציונליות של נוגדנים לכל אנטיגן טפיל קיים על פני השטח IE, אם מושרה על ידי חשיפה טבעית או על ידי חיסון. ההסכם מציע הערכה פשוטה ותפוקה גבוהה, עם רבייה טובה, של היבט תפקודי חשוב של חסינות בתיווך נוגדנים במלריה. זה, לכן, שימושי בעת הערכת חסינות קלינית P. falciparum מלריה, גורם מרכזי של תלודים ותמותה באזורים הטרופיים, במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה.

Introduction

מלריה היא מחלה הנישנת על ידי וקטור הנגרמת בבני אדם על זיהום עם חמישה מינים שונים של סוג Plasmodium. המינים הנפוצים ביותר הם P. falciparum, שאחראי גם על התפלואה והתמותה הגבוהותביותר 1. מצגת קלינית מלריה משתנה מזיהומים א-תסמינים או שפירים למחלה מסובכת/חמורה, האחרונה מתרחשת בעיקר בילדים מתחת לגיל חמש שנים. חשיפה P. falciparum אינה לגרום חסינות סטרילית, אבל אנשים החיים באזורים אנדמיים לאט לפתח חסינות מפני המחלה הקלינית. הגנה היא גיל / חשיפה תלויה חסינות נרכשת בדרך כלל במהלך 5-10 השנים הראשונות שלהחיים 2. נשים בוגרות הן יוצא מן הכלל חשוב, כמו מלריה חמורה יכולה להתרחש במהלך ההריון במצגת קלינית המכונה מלריה שליה (PM). ראש הממשלה היא סיבה חשובה להפלות, לידה מתות, לידה מוקדמת, משקל לידה נמוך, מוות עוברי ואנמיה אימהית. התנגדות לראש הממשלה מתפתחת על הריונות רצופים3. הגנה מפני PM קשורה לרכישת נוגדנים נגד PfEMP1 מסוג VAR2CSA4,5, אנטיגן אריתרושייט נגוע (IE) החייב לכונדרויטין גופרתי A (CSA) המאפשר IE סירוקציה שליה. נוגדנים לתווך הגנה ביצוע פעילויותפונקציונליות שונות (נבדק ב 6,,7)כולל opsonization של IEs כדי לגרום phagocytosis. מחקרים מוקדמים במבחנה הראו כי נוגדנים יכולים להגביל את צמיחת P. falciparum בנוכחות של מונוציטים באמצעות phagocytosis8,9. מחקרים עדכניים יותר הראו כי רמות גבוהות יותר של נוגדנים הזורמים פוגוציטוזיס קשורים לתוצאות הריון טובות יותר (בהקשר של HIV שיתוף זיהום)10,,11, המציין את הרלוונטיות של פונקציה זו אפקט בתגובה חיסונית שנרכשה באופן טבעי.

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד פונקציה זו של נוגדנים נוכחים פלזמה אנושית / סרום, באמצעות IEs מתורבתת חוץ חוץ להביע VAR2CSA יחד עם קו מונוצייט THP-1. ההסכם שימש בעבר11,12,13,14,15,16,17,18 והואנחשב גישה משופרת וקלה יותר בהשוואהפרוטוקולים מבוססי מיקרוסקופ קודם 8, שכן הוא מאפשר בדיקה של מספר גדול יותר של דגימות נוגדנים בריצה אחת באמצעות כמויות קטנות יותר של נוגדנים ונמנע ספירת מיקרוסקופים מייגעים ומוטה. למרות שהאסא היה בשימוש על ידי מעבדות מרובות וביצועו הוא פשוט מספיק, זה דורש תכנון והכנה זהירים, לכן, פרוטוקול מפורט יאפשר את יישומו על ידי מעבדות וחוקרים חסר ניסיון קודם. אנו משתמשים, כדוגמה, IEs בשלב מאוחר מסונכרן לבטא VAR2CSA opsonized עם נוגדנים נוכחים בסרום שנאספו מנשים עם חסינות ספציפית PM שנרכש באופן טבעי. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לומר את הפונקציונליות של נוגדנים לכל אנטיגן טפיל קיים על פני השטח IE, אם מושרה על ידי חשיפה טבעית או על ידי חיסון.

Protocol

דגימות הנסיוב האנושי המשמשות לתוצאות המוצגות כאן נאספו במחקר נפרד19. האוסף אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של מכון נוגוצ’י למחקר רפואי, אוניברסיטת גאנה (מחקר 038/10-11), ועל ידי ועדות האתיקה של המחקר האזורי, אזור הבירה של דנמרק (פרוטוקול H-4-2013-083). 1. תרבות טפילים <p class=…

Representative Results

כאן אנו מציגים בפירוט פרוטוקול שתואר בעבר31 והשתמש 11 ,12,13,14,15,15,16,17,18 כדי למדוד את הקיבולת של נוגדנים מיקוד פני השטח של P. falciparum …

Discussion

הפרוטוקול שהוצג כאן תואר בעבר ונעשה בושימוש 12,15,17,31 כדילמדוד את הקיבולת של נוגדנים מיקוד פני השטח של P. falciparum IEs כדי לגרום opsonization ו phagocytosis על ידי תאי THP-1.15 התוצאות המוצגות כאן מתמקדות בתרופות נוגדנים ספציפיות ל-VAR2CSA ש?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Maiken Visti הוא הודה על סיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק (MAVARECA II; 17-02-KU) ממשרד החוץ של דנמרק ומנוהלת על ידי מרכז המעבדות דנידה. ל-funder לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Materials

96 well cell culture plates, round bottom with lid Corning 3799 Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-II Gibco 11021-037
AlbuMAX-II (5%) 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibody Abcam ab34858 Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBS Sigma P8622
Dynabeads Protein G Invitrogen 10003D
Ethidium bromide solution Sigma E1510 Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometer Beckman Coulter Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10099-141 Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16 BD Biosciences 555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32 BD Biosciences 552883
FITC mouse anti-human CD64 BD Biosciences 555527
FlowLogic software Inivai technologies Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL) Sigma G1272
Hypoxanthine Sigma H9377
L-glutamine (200mM) Sigma G7513
Lysing solution 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesories Miltenyi Biotec 130-041-305
Parasite culture medium 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) Sigma P0781
RPMI-1640 medium Sigma R5886
THP-1 culture medium 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnet Miltenyi Biotec

References

  1. World Health Organization. World Malaria Report – 2018. World Health Organization. , (2018).
  2. Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
  3. Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
  4. Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
  5. Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
  6. Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
  7. Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
  8. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
  9. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
  10. Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
  11. Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
  12. Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
  13. Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
  14. Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
  15. Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
  16. Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
  17. Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
  18. Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
  19. Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
  20. Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
  21. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
  22. Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
  23. Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
  24. Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
  25. Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
  26. Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2013).
  27. WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s Guide. World Health Organization. , (1991).
  28. Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  29. Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc’yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
  30. Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
  31. Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).

Play Video

Cite This Article
Quintana, M. d. P., Anabire, N. G., Hviid, L. Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay. J. Vis. Exp. (162), e61538, doi:10.3791/61538 (2020).

View Video