L’objectif global de ce protocole est de fournir des instructions sur la façon de mesurer la capacité des anticorps présents dans les sérums ou le plasma des individus, naturellement exposés à l’infection de Plasmodium falciparum, d’opsoniser et d’induire la phagocytose des érythrocytes infectés par le parasite (EI).
Le protocole décrit comment mettre en place et exécuter un test de phagocytose à base de cytométrie de flux de Plasmodium falciparum-infectés érythrocytes (IE) opsonized par des anticorps IgG naturellement acquis spécifiques pour VAR2CSA. VAR2CSA est l’antigène parasite qui joue un médiateur dans la séquestration sélective des EI dans le placenta qui peut causer une forme grave de paludisme chez les femmes enceintes, appelée paludisme placentaire (PM). La protection contre les PARTICULES est médiée par des anticorps spécifiques à VAR2CSA qui sont censés fonctionner en inhibant la séquestration placentaire et/ou en opsonisant les EI pour la phagocytose. L’essai emploie des IE synchronisés à un stade avancé qui ont été sélectionnés in vitro pour exprimer VAR2CSA, plasma/sérique-anticorps de femmes avec l’immunité naturellement acquise pm-spécifique, et la ligne de cellules phagocytiques THP-1. Cependant, le protocole peut facilement être modifié pour évaluer la fonctionnalité des anticorps à tout antigène parasite présent sur la surface de l’IE, qu’il soit induit par une exposition naturelle ou par la vaccination. L’essai offre une évaluation simple et à haut débit, avec une bonne reproductibilité, d’un aspect fonctionnel important de l’immunité sous médiation des anticorps dans le paludisme. Il est donc utile lors de l’évaluation de l’immunité clinique contre le paludisme à P. falciparum, une cause majeure de morbidité et de mortalité sous les tropiques, en particulier en Afrique subsaharienne.
Le paludisme est une maladie à transmission vectorielle causée chez l’homme lors de l’infection par cinq espèces différentes du genre Plasmodium. L’espèce la plus répandue est P. falciparum, qui est également responsable de la plus grande morbidité et mortalité1. La présentation clinique du paludisme varie des infections asymptomatiques ou bénignes aux maladies compliquées/graves, ces dernières se produisant principalement chez les enfants de moins de cinq ans. L’exposition à P. falciparum n’induit pas l’immunité stérile, mais les individus vivant dans les zones endémiques développent lentement l’immunité contre la maladie clinique. La protection dépend de l’âge et de l’exposition et l’immunité est normalement acquise au cours des 5 à 10 premières années de vie2. Les femmes adultes sont une exception importante, car le paludisme sévère peut se produire pendant la grossesse dans une présentation clinique connue sous le nom de paludisme placentaire (PM). Le PM est une cause importante d’avortement, de mortinaissance, d’accouchement prématuré, de faible poids à la naissance, de mort fœtale et d’anémie maternelle. La résistance au PM se développe au cours des grossesses successives3. La protection contre les PARTICULES est associée à l’acquisition d’anticorps contre le type VAR2CSA PfEMP14,5, un antigène de surface infecté par l’érythrocyte (EI) qui se lie au sulfate de chondroïne A (ASC) permettant la séquestration de l’IE dans le placenta. Anticorps mediatise protection effectuant diverses activités fonctionnelles (examinés dans6,7) y compris l’opsonisation des IE pour induire la phagocytose. Des études in vitro précoces ont montré que les anticorps peuvent limiter la croissance de P. falciparum en présence de monocytes par phagocytose8,9. Des études plus récentes ont montré que des niveaux plus élevés d’anticorps induisant la phagocytose sont associés à de meilleurs résultats de la grossesse (dans le contexte de la co-infection par le VIH)10,11, indiquant la pertinence de cette fonction effecteur dans la réponse immunitaire acquise naturellement.
Ici, nous présentons un protocole pour mesurer cette fonction des anticorps présents dans le plasma humain / sérum, en utilisant in vitro cultivés IEs exprimant VAR2CSA avec la ligne de monocytes THP-1. L’essai a été précédemment utilisé11,12,13,14 ,15,16,17,,18 et est considéré comme une approche améliorée et plus facile par rapport aux protocoles antérieurs à base de microscope8, car il permet l’essai d’un plus grand nombre d’échantillons d’anticorps en une seule course en utilisant de plus petits volumes d’anticorps et en évitant le comptage fastidieux et biaisé de la microscopie.17 Même si l’essai a été utilisé par plusieurs laboratoires et que son exécution est assez simple, il nécessite une planification et une préparation minutieuses, par conséquent, un protocole détaillé permettrait son application par des laboratoires et des chercheurs dépourvus d’expérience antérieure. Nous utilisons, à titre d’exemple, des IE synchronisés à un stade avancé exprimant l’opsonized VAR2CSA avec des anticorps présents dans le sérum recueilli auprès des femmes atteintes d’une immunité spécifique aux PARTICULES naturellement acquise. Cependant, le protocole peut facilement être modifié pour évaluer la fonctionnalité des anticorps à tout antigène parasite présent sur la surface de l’IE, qu’il soit induit par une exposition naturelle ou par la vaccination.
Le protocole présenté ici a été précédemment décrit et utilisé12,15,17,31 pour mesurer la capacité des anticorps ciblant la surface des IEs de P. falciparum pour induire l’opsonisation et la phagocytose par les cellules de THP-1. Les résultats présentés ici se concentrent sur les anticorps naturellement acquis var2CSA-spécifiques dans le plasma / sérum des femmes vivant…
The authors have nothing to disclose.
Maiken Visti est remercié pour son excellente assistance technique. Ces travaux ont été financés en partie par une subvention (MAVARECA II; 17-02-KU) du Ministère des affaires étrangères du Danemark et administrée par le Danida Fellowship Centre. Le bailleur de fonds n’a joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
DPBS | Sigma | P8622 | |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |