Este artículo describe cómo realizar un método quirúrgico para inhibir la formación de epidermis de la herida durante la regeneración de las extremidades del ajolote mediante la sutura inmediata de piel de espesor completo sobre el plano de amputación. Este método permite a los investigadores investigar las funciones funcionales de la epidermis de la herida durante las primeras etapas de la regeneración de las extremidades.
Los experimentos clásicos en biología regenerativa de salamandras durante el último siglo han establecido durante mucho tiempo que la epidermis de la herida es una estructura de señalización crucial que se forma rápidamente después de la amputación y es necesaria para la regeneración de las extremidades. Sin embargo, los métodos para estudiar su función precisa a nivel molecular en las últimas décadas han sido limitados debido a la escasez de técnicas funcionales precisas e información genómica disponible en los sistemas modelo de salamandras. Emocionantemente, la reciente plétora de tecnologías de secuenciación junto con la liberación de varios genomas de salamandras y el advenimiento de métodos de prueba genética funcionales, incluido CRISPR, hace posible volver a visitar estos experimentos fundacionales a una resolución molecular sin precedentes. Aquí, describo cómo realizar la cirugía de colgajo cutáneo completo (FSF) desarrollada clásicamente en axolotl adultos para inhibir la formación de epidermis de la herida inmediatamente después de la amputación. La epidermis de la herida normalmente se forma a través de la migración distal de las células epiteliales en la piel proximal al plano de amputación para sellar la herida del entorno exterior. La cirugía implica la sutura inmediata de piel de espesor completo (que incluye capas epidérmicas y dérmicas) sobre el plano de amputación para dificultar la migración de células epiteliales y el contacto con los tejidos mesenquimales dañados subyacentes. Las cirugías exitosas resultan en la inhibición de la formación de blastemas y la regeneración de las extremidades. Al combinar este método de cirugía con análisis moleculares y funcionales contemporáneos, los investigadores pueden comenzar a descubrir los fundamentos moleculares de la función de la epidermis de la herida y la biología durante la regeneración de las extremidades.
Desde que Lazzaro Spallanzani lo informó en 17681, la regeneración de las extremidades de la salamandra ha sido uno de los fenómenos regenerativos naturales más estudiados que ha enamorado a los biólogos durante siglos. La regeneración exitosa de las extremidades depende de la formación, el crecimiento y el patrón posterior de una estructura celular indiferenciada conocida como blastema. Los investigadores han logrado avances significativos en la comprensión de la composición celular del blastema, así como qué tejidos de soporte y tipos de células son necesarios para su formación2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Sin embargo, los mecanismos de señalización coordinados entre diferentes tejidos y tipos de células que conducen al inicio de la formación de blastemas siguen siendo poco conocidos.
Un requisito clave para la formación y regeneración exitosa del blastema es la epidermis de la herida, un epitelio transitorio y especializado que cubre el plano de amputación dentro de las 12 horas posteriores a la amputación10. Después de la amputación, las células epiteliales de la piel intacta proximal a la lesión migran rápidamente sobre el plano de amputación para formar un epitelio de herida delgada14. A medida que el blastema se forma en las semanas siguientes, la epidermis de la herida temprana se convierte en una estructura de señalización epitelial más gruesa llamada capuchón epitelial apical (AEC)15. Mientras que la piel normal de espesor completo contiene una capa epitelial y dérmica separada por una lámina basal, la epidermis de la herida/AEC consiste únicamente en una capa epitelial y carece de una lámina basal16,17. La ausencia de la lámina basal y la dermis permite el contacto directo entre las células epiteliales de la herida y los tejidos subyacentes, lo que facilita la señalización bidireccional entre los dos compartimentos, que es crítica tanto para la formación como para el mantenimiento del blastema17,18.
Los estudios experimentales clásicos idearon varios métodos quirúrgicos innovadores para sondear la función y la necesidad de la epidermis / AEC de la herida a través de la inhibición de su formación. Estos métodos incluyeron la sutura19 o el injerto de piel de espesor completo20,21 sobre el plano de amputación, la sutura inmediata de la extremidad amputada en la cavidad corporal22 y la extracción o irradiación diaria continua de la epidermis de la herida temprana y la AEC23,24. En conjunto, estos experimentos no solo establecieron la importancia de la epidermis de la herida/AEC, sino que también determinaron aún más su papel en la histólisis tisular temprana, así como en el mantenimiento de la proliferación de células progenitoras y el crecimiento blastemal13 a lo largo de la regeneración.
Sin embargo, estos estudios previos se limitaron en gran medida a la tinción histológica, así como a los pulsos de timidina tritiados para rastrear la proliferación celular. De hecho, la revisión de estos experimentos clásicos con tecnologías modernas de secuenciación y técnicas funcionales en salamandras se ha realizado recientemente y ha llevado al descubrimiento de roles adicionales para la epidermis de la herida en la modulación de la inflamación y la degradación / deposición de ECM durante las primeras etapas de la regeneración25. Con la liberación de varias secuencias del genoma y transcriptoma de la salamandra26,27,28,29,30,31,32,33,34, así como el creciente número de métodos funcionales disponibles en las especies de salamandras11,35,36,37,38 , los investigadores ahora están bien posicionados para comenzar a desentrañar los mecanismos moleculares que impulsan la formación de la epidermis de la herida, la función y el desarrollo de AEC.
Desafortunadamente, varios de estos métodos clásicos utilizados para inhibir la formación de la epidermis de la herida son técnicamente desafiantes, presentando dificultades para la reproducibilidad entre réplicas biológicas en el mismo experimento. Por ejemplo, mantener los injertos de piel puede ser un desafío, ya que los injertos pueden eventualmente caerse de la extremidad huésped y la extirpación de la epidermis de la herida / AEC diariamente es difícil sin dañar los tejidos subyacentes. Además, suturar la extremidad amputada en la cavidad corporal es un desafío y también requiere una lesión adicional en el sitio de inserción. Por otro lado, suturar la piel de espesor completo inmediatamente sobre el plano de amputación es relativamente simple, técnicamente reproducible e introduce un daño tisular mínimo. Este método quirúrgico de colgajo de piel completa (FSF) fue desarrollado previamente por Anthony Mescher en 1976 en tritones adultos (Notophthalmus viridiscens). Demostró que la cirugía FSF inhibió la formación y función de la epidermis de la herida al prohibir tanto la migración de células epiteliales sobre el plano de amputación como el contacto directo entre las células epiteliales y los tejidos subyacentes.
Aquí, este procedimiento quirúrgico se muestra paso a paso utilizando la extremidad axolotl. Junto con las tecnologías moleculares y de secuenciación modernas, esta técnica puede resultar muy útil para que los investigadores profundicen nuestra comprensión de la formación y función de la epidermis de la herida / AEC durante la regeneración de las extremidades.
Este artículo describe un protocolo para realizar cirugías de colgajo cutáneo completo en extremidades axolotl para inhibir la formación de epidermis de la herida. Si bien esta cirugía es relativamente simple y técnicamente reproducible en comparación con otros métodos para inhibir la formación de la epidermis de la herida, hay varios pasos críticos que pueden afectar el éxito de la cirugía. Primero, al tirar del colgajo de piel completa intacta sobre los tejidos subyacentes expuestos, es primordial que la piel de espesor completo no se dañe de ninguna manera. El daño al colgajo de la piel aún puede conducir a la formación de una pequeña epidermis de la herida, lo que puede resultar en una pequeña excrecencia similar a un blastema. En segundo lugar, asegúrese de que las suturas no se caigan durante el cuidado postoperatorio, ya que esto también puede conducir a la formación de una pequeña epidermis de la herida. Hasta este punto, minimizar el contacto potencial entre la extremidad suturada y cualquier superficie es importante, especialmente durante la primera semana después de la cirugía. Varias formas de prevenir esto implican alojar y anestesiar el axolotl en un recipiente lo suficientemente grande como para que el axolotl tenga mucho espacio para moverse después de la cirugía.
Esta cirugía también tiene varias limitaciones. Quizás lo más notable es que el éxito de las cirugías solo se puede evaluar de dos maneras: utilizando el endoscopio de disección durante las primeras dos semanas de la cirugía para buscar la ausencia de una epidermis de la herida y / o verificando si se forma un blastema dentro de las 3 semanas. Si bien estos métodos son efectivos, tienen un rendimiento relativamente bajo. El desarrollo de futuros axolotl reporteros transgénicos para marcadores específicos de la epidermis de la herida puede ayudar a una detección más rápida de las cirugías exitosas frente a las no exitosas. Además, esta cirugía es más difícil de realizar en animales más jóvenes ya que la piel intacta es más frágil. Por lo tanto, se recomienda el uso de ajolotes subadultos o adultos.
Si bien esta cirugía se desarrolló originalmente en N. viridiscens19, se ha adaptado fácilmente para axolotls25,39 y es probable que también se pueda aplicar a otras especies de salamandras. En resumen, la aplicación de esta técnica a futuros estudios regenerativos de extremidades permitirá a los investigadores desarrollar más herramientas para abordar la biología de la epidermis de la herida e identificar los mecanismos subyacentes que impulsan su función en el inicio de la formación de blastemas.
The authors have nothing to disclose.
El autor agradece a Doug por su constante aliento y apoyo inquebrantable, así como a los miembros del laboratorio Melton por sus útiles comentarios y comentarios sobre el manuscrito. El autor también desea agradecer a la Oficina de Recursos Animales de Harvard (OAR) por su dedicado cuidado de los animales.
Curved spring scissors | Fine Scientific Tools | 15009-08 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | Need two pairs |
Nylon monofilament sutures (9-0) | Roboz | SUT-1000-21 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Stereo microscope | Leica | MZ6 | |
Sulfamerazine sodium salt | Sigma-Aldrich | 127-58-2 | |
Surgical scissors | Fine Scientific Tools | 14002-14 |