本文介绍了如何通过立即在截肢平面上缝合全层皮肤来执行手术方法,以抑制蝾螈肢体再生期间伤口表皮的形成。这种方法使研究人员能够研究伤口表皮在肢体再生早期阶段的功能作用。
上个世纪蝾螈再生生物学的经典实验早已确定,伤口表皮是截肢后迅速形成的关键信号结构,是肢体再生所必需的。然而,在过去的几十年中,由于蝾螈模型系统中缺乏精确的功能技术和基因组信息,在分子水平上研究其精确功能的方法受到限制。令人兴奋的是,最近过多的测序技术加上各种蝾螈基因组的发布以及包括CRISPR在内的功能性基因检测方法的出现,使得以前所未有的分子分辨率重新审视这些基础实验成为可能。在这里,我描述了如何在成人蝾螈中进行经典开发的全皮瓣(FSF)手术,以抑制截肢后立即形成伤口表皮。伤口表皮通常通过皮肤近端上皮细胞的远端迁移到截肢平面形成,以将伤口与外部环境隔离开来。手术需要立即在截肢平面上缝合全层皮肤(包括表皮层和真皮层),以阻碍上皮细胞迁移和与潜在受损间充质组织的接触。成功的手术可抑制卵涌卵形成和肢体再生。通过将这种手术方法与当代下游分子和功能分析相结合,研究人员可以开始揭示肢体再生过程中伤口表皮功能和生物学的分子基础。
自从Lazzaro Spallanzani在17681年报道以来,蝾螈肢体再生一直是几个世纪以来一直迷恋生物学家的最充分研究的自然再生现象之一。成功的肢体再生取决于未分化细胞结构(称为胚芽肿)的形成、生长和随后的模式化。研究人员在了解卵涌水肿的细胞组成以及哪些支持组织和细胞类型是其形成所必需的方面取得了重大进展2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13.然而,导致启动原始细胞瘤形成的不同组织和细胞类型之间的协调信号传导机制仍然知之甚少。
成功形成和再生母细胞瘤的关键要求是伤口表皮,这是一种短暂的特化上皮,在截肢后12小时内覆盖截肢平面10。截肢后,从完整皮肤近端到损伤的上皮细胞迅速通过截肢平面迁移,形成薄薄的伤口上皮14。随着芽生菌在接下来的几周内形成,早期伤口表皮发展成更厚的上皮信号传导结构,称为顶端上皮帽(AEC)15。虽然正常的全层皮肤包含由基底层隔开的上皮层和真皮层,但伤口表皮/ AEC仅由上皮层组成,缺乏基底层16,17。基底层和真皮层的缺失允许伤口上皮细胞与下层组织之间直接接触,这有助于两个隔室之间的双向信号传导,这对芽生水肿的形成和维持至关重要17,18。
经典的实验研究设计了各种创新的手术方法,通过抑制伤口表皮/ AEC的功能和必要性来探测其形成。这些方法包括缝合19或将全层皮肤20,21移植到截肢平面上,立即将截肢缝合到体腔22中,以及连续每天移除或照射早期伤口表皮和AEC23,24。总而言之,这些实验不仅确定了伤口表皮/ AEC的重要性,而且还进一步确定了其在早期组织组织分解中的作用,以及在整个再生过程中维持祖细胞增殖和原始细胞生长13。
然而,这些先前的研究主要局限于组织学染色以及经三联胸腺嘧啶脉冲以跟踪细胞增殖。事实上,用现代测序技术和蝾螈的功能技术重新审视这些经典实验直到最近才完成,并导致发现伤口表皮在再生早期阶段调节炎症和ECM降解/沉积的其他作用25。随着各种蝾螈基因组和转录组序列的释放26,27,28,29,30,31,32,33,34,以及蝾螈物种中可用的功能方法数量的迅速增加11,35,36,37,38研究人员现在处于有利地位,可以开始解开驱动伤口表皮形成,功能和AEC发展的分子机制。
不幸的是,用于抑制伤口表皮形成的这些经典方法中的几种在技术上具有挑战性,在同一实验中,生物重复之间的可重复性存在困难。例如,维持皮肤移植物可能具有挑战性,因为移植物最终可能会从宿主肢体上脱落,并且每天切除伤口表皮/ AEC很难不损坏下面的组织。此外,将截肢缝合到体腔中具有挑战性,并且还需要在插入部位进行额外的伤害。另一方面,在截肢平面上立即缝合全层皮肤相对简单,技术上可重复,并且引入的组织损伤最小。这种全皮瓣(FSF)手术方法以前由Anthony Mescher于1976年在成年蝾螈(Notophthalmus viridiscens)中开发。他证明,FSF手术通过禁止上皮细胞在截肢平面上的迁移以及上皮细胞与下层组织之间的直接接触来抑制伤口表皮的形成和功能。
在这里,该外科手术使用蝾螈肢体逐步显示。结合现代分子和测序技术,这种技术可能有助于研究人员加深我们对伤口表皮/AEC形成和肢体再生过程中功能的理解。
本文介绍了在蝾螈四肢中进行全皮瓣手术以抑制伤口表皮形成的方案。虽然与其他抑制伤口表皮形成的方法相比,这种手术相对简单,技术上可重复,但有几个关键步骤可以影响手术的成功。首先,当将完整的全皮瓣拉过暴露的下层组织时,至关重要的是,全层皮肤不会以任何方式受损。对皮瓣的损伤仍可导致小伤口表皮的形成,从而导致小的胚泡样生长。其次,确保缝合线在术后护理期间不会脱落,因为这也可能导致小伤口表皮的形成。在这一点上,尽量减少缝合肢体与任何表面之间的潜在接触非常重要,特别是在手术后的第一周。预防这种情况的几种方法需要在足够大的容器中容纳和麻醉蝾螈,以便蝾螈有足够的空间在手术后四处移动。
这种手术也有几个局限性。也许最值得注意的是,手术的成功只能通过两种方式进行评估:在手术的前两周使用解剖范围寻找伤口表皮的缺失和/或检查3周内是否形成血涌水肿。虽然这些方法有效,但它们的吞吐量相对较低。未来用于伤口表皮特异性标志物的转基因报告蝾螈的开发可能有助于更快地筛查成功与失败的手术。此外,这种手术在年轻的动物身上更难进行,因为完整的皮肤更脆弱。因此,建议使用亚成人或成人蝾螈。
虽然这种手术最初是在N. viridiscens19中开发的,但它很容易适应蝾螈25,39,并且可能也适用于其他蝾螈物种。总而言之,将这种技术应用于未来的肢体再生研究将使研究人员能够开发更多工具来解决伤口表皮生物学问题,并确定驱动其启动卵涌水肿形成功能的潜在机制。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢Doug的不断鼓励和坚定不移的支持,以及Melton实验室成员对手稿的有益反馈和评论。作者还要感谢哈佛大学动物资源办公室(OAR)对动物的专注照顾。
Curved spring scissors | Fine Scientific Tools | 15009-08 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | Need two pairs |
Nylon monofilament sutures (9-0) | Roboz | SUT-1000-21 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Stereo microscope | Leica | MZ6 | |
Sulfamerazine sodium salt | Sigma-Aldrich | 127-58-2 | |
Surgical scissors | Fine Scientific Tools | 14002-14 |