В этой статье мы описываем метод измерения гликолиза и митохондриального дыхания в первичных клетках естественного убийцы человека (НК), изолированных от периферической крови, в состоянии покоя или после активации, вызванной IL15. Описанный протокол может быть легко распространен на первичные клетки НК человека, активированные другими цитокинами или растворимыми стимулами.
Естественные клетки Killer (NK) опосредуют главным образом врожденные противоопухолесные и противовирусные иммунные реакции и реагируют на различные цитокины и другие стимулы для содействия выживанию, клеточному распространению, выработке цитокинов, таких как гамма интерферона (ИФНЗ) и/или программы цитотоксичности. Активация НК-клеток при стимуляции цитокинов требует существенной реконструкции метаболических путей для поддержки их биоэнергетических и биосинтетических потребностей. Существует большое количество доказательств того, что нарушение метаболизма нк-клеток связано с рядом хронических заболеваний, включая ожирение и рак, что подчеркивает клиническую важность наличия метода для определения метаболизма нк-клеток. Здесь мы описываем использование внеклеточного анализатора потока, платформы, которая позволяет в режиме реального времени измерения гликолиза и митохондриального потребления кислорода, в качестве инструмента для мониторинга изменений в энергетическом метаболизме клеток НК человека. Описанный здесь метод также позволяет контролировать метаболические изменения после стимуляции НК-клеток с цитокинами, такими как IL-15, система, которая в настоящее время изучается в широком диапазоне клинических испытаний.
Природные клетки Killer (NK) являются врожденными лимфоцитами, которые являются посредниками противоопухоленных и противовирусных реакций. НК-клетки составляют 5-15% всех лимфоцитов в периферической крови человека, а также могут быть найдены в селезенке, печени, костном мозге и лимфатических узлах. НК-клетки не выражают полиморфные клонотичные рецепторы, такие как Т-клеточные рецепторы (TCR) или B-клеточные рецепторы (BCR). В отличие от этого, активация их цитолитических функций вызвана вовлечением рецепторов, которые распознают неизменные лиганды на поверхностицелевой клетки 1,,2.
Отдыхающие клетки НК человека, изолированные от периферической крови, могут прожить несколько дней в культурной среде, дополненной сывороткой человека. Активация НК-клеток цитокинами, такими как IL-15 или IL-2, приводит клетки к пролиферации и увеличению их способности убивать,среди прочих эффектов 3,,4,,5. Несколько исследований показали прямую корреляцию между активацией НК-клеток и изменениями в их метаболическойактивности 6. Эти метаболические изменения предназначены для удовлетворения конкретных потребностей клеток с точки зрения энергии и биосинтеза.
Аэробные клетки и организмы получают энергию через ряд химических реакций, которые включают катаболизм и окисление углеводов, жиров и белков. Благодаря сочетанию гликолиза, трикарбоксиновой кислоты (TCA) цикла и окислительного фосфорилирования, эукариотические клетки отвечают большинству их спроса АТФ и получить промежуточные необходимые в качестве строительных блоков для макромолекул, необходимых для роста клеток и распространения. Процесс гликолиза(рисунок 1A) начинается с ввода глюкозы в клетку. В цитозоле глюкоза фосфорилируется и преобразуется в пируват (с чистым производством 2 молекул АТФ на молекулу глюкозы), которые могут быть сведены к лактату или транспортированы в митохондрии, чтобы быть преобразованы в Ацетил-КоА и войти в цикл TCA. Цикл TCA продолжает езда на велосипеде подпитывается больше молекул Ацетил-КоА и производит CO 2 (чтов конечном итоге будет распространяться за пределами клетки и, реагируя с H2O в среде, будет генерировать углеродную кислоту, которая приведет к подкислению среды) и NADH, молекула отвечает за пожертвование электронов в электронной транспортной цепи (ETC). Электроны проходят через различные белковые комплексы и, наконец, принимаются кислородом. Эти комплексы (I, III и IV) также перекачивают H– из митохондриальной матрицы в пространство с интермембрана. В результате генерируемого электрохимического+ градиента, H- снова войдет в матрицу через комплекс V (ATP-синтазы), инвестируя потенциальную энергию, накопленную в генерацию АТФ.
Как гликолиз, так и митохондриальное дыхание могут быть заблокированы в разных точках с помощью ингибиторов. Знание и использование этих ингибиторов было основой для развития внеклеточного анализа потока. Измеряя два простых параметра в режиме реального времени, таких как рН и кислород, экстраклеточный анализатор потока делает вывод о скорости гликолиза и митохондриального дыхания в 96-хорошо пластины. Стресс-тест на гликолиз проводится в базальной среде без глюкозы(рисунок 1B)7. Первые измерения уровня внеклеточного подкисления (ECAR) свидетельствуют о гликолиз-независимом подкислению. Он называется негликолитической подкисления и коррелирует с CO2 производства TCA, что, как уже объяснялось ранее, сочетается с H2O в среде длягенерации H q (TCA-связанных ECAR). Первая инъекция глюкозы, чтобы вызвать использование глюкозы и повысить гликолиз. Вторая инъекция сочетает в себе как ротенон, ингибитор комплекса I, так и антимицин А, ингибитор комплекса III вместе, чтобы блокировать ETC. Клетки реагируют на это резкое снижение производства митохондриального АТФ путем активации гликолиза для поддержания клеточного уровня АТФ, и это представляет собой количество гликолиза, который не используется клеткой в базальном состоянии, но потенциально может быть завербован в ответ на увеличение спроса на АТФ. Третьей инъекцией является аналог глюкозы 2-Deoxyglucose (DG), который конкурирует с глюкозой в качестве субстрата для фермента гексокиназы. Продукт этого фосфорилирования, 2-дезиглиглукозы-6-фосфат не может быть преобразован в пируват, и поэтому гликолиз блокируется, что снижает ECAR до минимума. ECAR измеряется на данный момент включает в себя другие источники внеклеточного подкисления, которые не связаны с гликолизом или дыхательной деятельности, а также любой остаточный гликолиз не полностью ингибируется 2-DG (пост 2-DG-подкисления).
Митохондриальный стресс-тест проводится в среде с глюкозой(рисунок 1C)8. Первые измерения скорости потребления кислорода (OCR) соответствуют базовой линии митохондриального дыхания (базального дыхания). Первая инъекция олигомицин, который препятствует возвращению протонов через синтазу АТФ (комплекс V), блокируя синтез АТФ и тем самым быстро гиперполяризирует митохондриальную мембрану, что предотвращает дальнейшую прокачку протонов через дыхательные комплексы, и приводит к снижению OCR. Сравнение базового дыхания и значения, данное добавлением олигомицина, представляет собой дыхание, связанное с АТФ. Оставшаяся олигомицин-нечувствительная скорость потребления кислорода называется протонной утечкой, которая представляет поток протонов через липидный билейзер или белки во внутренней митохондриальной мембране, такие как адениновым нуклеотиднымтранзислойдом 9. Вторая инъекция является uncoupler 2,4-динитрофенол (DNP), ионофотор, который вызывает массовое вступлениеH в митохондриальной матрицы, что приводит к деполяризации митохондриальной мембраны и нарушение митохондриального синтеза АТФ. Клетки реагируют на рассеивание протонно-мотивной силы, увеличивая скорость транспортировки электронов и потребления кислорода до максимального уровня в тщетной попытке восстановить мембранный потенциал (максимальная дыхательная способность). Разница между максимальной дыхательной способности и базального дыхания запасных дыхательной способности клетки, которая представляет собой количество дыхания, которое не используется клеткой для создания АТФ в базальной состоянии, но потенциально может быть набран в ответ на увеличение спроса АТФ или вусловиях стресса 8. Третья инъекция представляет собой сочетание ротенона и антимицина А. Эта инъекция полностью останавливает ETC и OCR уменьшается до самого низкого уровня, при этом оставшееся потребление кислорода не митохондриальное (вызванное NADPH-оксидами и т.д.).
Изменения в метаболических путей может каким-то образом предсказать функционирование НК-клеток, как было высказано предположение, что непрерывная активация НК-клеток с цитокинами в пробирке может привести к истощению НК клеток путем изучения различных метаболическихпутей 10,11. Корреляция между метаболическим статусом и функцией НК-клеток очень важна с точки зрения иммунотерапии рака. В этой области, активация НК-клеток с вливанием IL-15, в одиночку или в сочетании с моноклональными терапевтическими антителами были протестированы для того, чтобы улучшить опухолевыеклетки убийство 12,13,14. Знание метаболического статуса НК-клеток в ответ на эти стратегии лечения обеспечит ценный предиктор статуса активации нк-клеток и функции убийства.
Изучение метаболических путей в других миелоидных и лимфоидных клеток, таких как моноциты, Т и Вклетки были описаны 15 и оптимизированные методы былиопубликованы 16. В этом протоколе мы предоставляем метод, который сочетает в себе как протокол изоляции НК, который дает большое количество чистых и жизнеспособных НК-клеток, так и оптимизированный протокол для измерения метаболической активности с помощью внеклеточного анализатора потока. Здесь мы показываем, что это действительный метод для изучения метаболических изменений в отдыха и IL-15 активированных клеток человека НК. Для анализа внеклеточного потока были протестированы и оптимизированы такие параметры, как количество клеток и концентрации наркотиков. По сравнению с другими респирометрическими методами, экстраклеточный анализатор потока полностью автоматизирован и способен тестировать в режиме реального времени, с очень низким количеством клеток, до 92 образцов одновременно, и, таким образом, позволяет высокую пропускную способность скринингов (с несколькими образцами и репликациями)в относительно быстром порядке 17.
Этот метод может быть использован исследователями, заинтересованными в оценке функции НК-клеток путем изучения метаболизма НК-клеток. Он может быть применен также к клеткам, активированным другими цитокинами, антителами или растворимыми стимулами.
В этой статье мы установили протокол для эффективной изоляции и культивирования чистых и жизнеспособных первичных клеток НК человека из периферической крови. Мы также оптимизировали условия для измерения метаболической активности этих НК-клеток, оцениваемых по скорости потребления …
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят д-ра Майкла Н. Сака (Национальный институт сердца, легких и крови) за поддержку и обсуждение. Это исследование было поддержано интрамуральными исследовательскими программами Национальных институтов здравоохранения, Национального института рака и Национального института сердца, легких и крови. JT поддерживается программой Рамон у Cajal (грант RYC2018-026050-I) MICINN (Испания).
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |