Summary

Analyse du métabolisme des cellules tueuses naturelles humaines

Published: June 22, 2020
doi:

Summary

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les cellules humaines primaires de tueur naturel (NK) isolées du sang périphérique, au repos ou après l’activation induite par l’IL15. Le protocole décrit pourrait être facilement étendu aux cellules NK humaines primaires activées par d’autres cytokines ou stimuli solubles.

Abstract

Les cellules tueurs naturels (NK) interviennent principalement des réponses immunitaires antitumorales et antivirales innées et répondent à une variété de cytokines et d’autres stimuli pour favoriser la survie, la prolifération cellulaire, la production de cytokines telles que les programmes d’interféron gamma (IFNγ) et/ou de cytotoxicité. L’activation des cellules NK par stimulation de cytokine nécessite un remodelage substantiel des voies métaboliques pour soutenir leurs besoins bioénergétiques et biosynthétiques. Il existe un grand nombre de preuves qui suggèrent que le métabolisme altéré des cellules NK est associé à un certain nombre de maladies chroniques, y compris l’obésité et le cancer, ce qui souligne l’importance clinique de la disponibilité d’une méthode pour déterminer le métabolisme cellulaire NK. Ici, nous décrivons l’utilisation d’un analyseur de flux extracellulaire, une plate-forme qui permet des mesures en temps réel de la glycolyse et de la consommation d’oxygène mitochondrial, comme un outil pour surveiller les changements dans le métabolisme énergétique des cellules humaines NK. La méthode décrite ici permet également la surveillance des changements métaboliques après la stimulation des cellules NK avec des cytokines telles que l’IL-15, un système qui est actuellement à l’étude dans un large éventail d’essais cliniques.

Introduction

Les cellules de tueur naturel (NK) sont des lymphocytes innés qui pédiment les réponses anti-tumorales et antivirales. Les cellules NK représentent 5 à 15 % de tous les lymphocytes dans le sang périphérique humain, et peuvent également être trouvées dans la rate, le foie, la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques. Les cellules NK n’expriment pas les récepteurs clonotypic polymorphes, tels que les récepteurs à cellules T (TCR) ou les récepteurs à cellules B (BCR). En revanche, l’activation de leurs fonctions cytolytiques est motivée par l’engagement de récepteurs qui reconnaissent les ligands invariables à la surface d’une cellule cible1,2.

Les cellules nk humaines au repos isolées du sang périphérique peuvent survivre pendant plusieurs jours dans le milieu de culture complété avec le sérum humain. L’activation des cellules NK par des cytokines telles que l’IL-15 ou l’IL-2 entraîne la prolifération des cellules et une augmentation de leur capacité de tuer, entre autres effets3,4,5. Plusieurs études ont montré une corrélation directe entre l’activation des cellules NK et les changements dans leur activité métabolique6. Ces changements métaboliques sont destinés à répondre aux exigences particulières des cellules en termes d’énergie et de biosynthèse.

Les cellules et les organismes aérobiques obtiennent de l’énergie grâce à une série de réactions chimiques qui impliquent le catabolisme et l’oxydation des glucides, des graisses et des protéines. Grâce à une combinaison de glycolyse, le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, les cellules eucaryotes répondent à la majorité de leur demande d’ATP et obtiennent des intermédiaires requis comme éléments constitutifs des macromolécules essentielles à la croissance et à la prolifération des cellules. Le processus de glycolyse (figure 1A) commence par l’entrée du glucose dans la cellule. Dans le cytosol, le glucose est phosphorylé et transformé en pyruvate (avec une production nette de 2 molécules d’ATP par molécule de glucose), qui peut être réduit au lactate ou transporté dans les mitochondries pour être transformé en Acétyl-CoA et entrer dans le cycle TCA. Le cycle TCA continue le cycle alimenté avec plus de molécules d’Acétyl-CoA et produit du CO2 (qui finira par se diffuser à l’extérieur de la cellule et, en réagissant avec H2O dans le milieu, générera de l’acide carbonique qui conduira à l’acidification du milieu) et NADH, la molécule en charge de donner des électrons à la chaîne de transport d’électrons (ETC). Les électrons voyagent à travers différents complexes protéiques et sont finalement acceptés par l’oxygène. Ces complexes (I, III et IV) pompent également H+ de la matrice mitochondriale dans l’espace intermembrane. En conséquence du gradient électrochimique généré, le H+ entrera à nouveau dans la matrice à travers le complexe V (ATP-synthase), en investissant l’énergie potentielle accumulée dans la génération d’ATP.

La glycolyse et la respiration mitochondriale peuvent être bloquées à différents points en utilisant des inhibiteurs. La connaissance et l’utilisation de ces inhibiteurs ont été la base pour le développement de l’essai de flux extracellulaire. En mesurant deux paramètres simples en temps réel comme le pH et l’oxygène, l’analyseur de flux extracellulaire infère le taux de glycolyse et de respiration mitochondriale dans une plaque de 96 puits. Le test de résistance à la glycolyse est effectué dans un milieu basal sans glucose (Figure 1B)7. Les premières mesures du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) sont indicatives de l’acidification indépendante de la glycolyse. Il est appelé acidification non glycolytique et est en corrélation avec le CO2 produit par le TCA qui, comme expliqué précédemment, se combine avec H2O dans le milieu pour générer H+ (ECAR lié au TCA). La première injection est le glucose pour induire l’utilisation du glucose et stimuler la glycolyse. La deuxième injection combine à la fois la roténone, un inhibiteur du complexe I, et l’antimycine A, un inhibiteur complexe III ensemble, pour bloquer l’ETC. Les cellules répondent à cette diminution spectaculaire de la production d’ATP mitochondrial en activant la glycolyse pour maintenir les niveaux d’ATP cellulaire, ce qui représente la quantité de glycolyse qui n’est pas utilisée par la cellule dans l’état basal mais pourrait être potentiellement recrutée en réponse à l’augmentation de la demande d’ATP (glycolyse compensatoiree). La troisième injection est l’analogue du glucose 2-Désoxyglucose (DG), qui rivalise avec le glucose comme substrat pour l’enzyme hexokinase. Le produit de cette phosphorylation, 2-désoxyglucose-6-phosphate ne peut pas être transformé en pyruvate, et donc la glycolyse est bloquée, ce qui abaisse l’ECAR à son minimum. L’ECAR mesurée à ce stade comprend d’autres sources d’acidification extracellulaire qui ne sont pas attribuées à la glycolyse ou à l’activité respiratoire ainsi que toute glycolyse résiduelle non totalement inhibée par 2-DG (post 2-DG-acidification).

Le test de stress mitochondrial est effectué dans un milieu avec du glucose (Figure 1C)8. Les premières mesures du taux de consommation d’oxygène (OCR) correspondent à la ligne de base de la respiration mitochondriale (respiration basale). La première injection est l’oligomycine, qui inhibe le retour des protons par la synthase ATP (complexe V), bloquant la synthèse de l’ATP et donc hyperpolariser rapidement la membrane mitochondriale, ce qui empêche le pompage de protons par les complexes respiratoires, et conduit à une diminution de l’OCR. La comparaison entre la respiration de base et la valeur donnée par addition d’oligomycine représente la respiration liée à l’ATP. Le taux restant d’oligomycine insensible à la consommation d’oxygène est appelé fuite de protons, qui représente le flux de protons à travers la bicouche lipidique ou les protéines dans la membrane mitochondriale interne comme le translocale nucléotide adénine9. La deuxième injection est le uncoupler 2,4-dinitrophénol (DNP), une ionophore qui induit une entrée massive de H+ dans la matrice mitochondriale, ce qui conduit à la dépolarisation de la membrane mitochondriale et la perturbation de la synthèse mitochondriale ATP. Les cellules réagissent à la dissipation de la force proton-motrice en augmentant le taux de transport des électrons et la consommation d’oxygène à des niveaux maximums dans une tentative futile de récupérer le potentiel de la membrane (capacité respiratoire maximale). La différence entre la capacité respiratoire maximale et la respiration basale est la capacité respiratoire de rechange de la cellule, qui représente la quantité de respiration qui n’est pas utilisée par la cellule pour générer de l’ATP dans l’état basal, mais qui pourrait être potentiellement recrutée en réponse à l’augmentation de la demande d’ATP ou dans des conditions de stress8. La troisième injection est une combinaison de roténone et d’antimycine A. Cette injection arrête complètement l’ETC et l’OCR diminue à son niveau le plus bas, la consommation d’oxygène restante étant non mitochondriale (causée par les NADPH-oxydases, etc.).

Les changements dans les voies métaboliques pourraient en quelque sorte prédire le fonctionnement des cellules NK, car il a été suggéré que l’activation continue des cellules NK avec des cytokines in vitro pourrait conduire à l’épuisement cellulaire NK par l’étude des différentes voies métaboliques10,11. La corrélation entre le statut métabolique des cellules NK et la fonction est très importante du point de vue de l’immunothérapie contre le cancer. Dans ce domaine, l’activation des cellules NK avec perfusion d’IL-15, seule ou en combinaison avec des anticorps thérapeutiques monoclonaux ont été testées afin d’améliorer la cellule tumorale tuant12,13,14. La connaissance de l’état métabolique des cellules NK en réponse à ces stratégies de traitement fournirait un prédicteur précieux de l’état d’activation des cellules NK et de la fonction de mise à mort.

L’étude des voies métaboliques dans d’autres cellules myéloïdes et lymphoïdes telles que les monocytes, les cellules T et B a été décrite15 et des méthodes optimisées ont été publiées16. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode qui combine à la fois un protocole d’isolement NK qui produit un nombre élevé de cellules NK pures et viables et un protocole optimisé pour mesurer l’activité métabolique à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. Ici, nous montrons qu’il s’agit d’une méthode valable pour l’étude des changements métaboliques dans le repos et IL-15 activé cellules NK humaines. Pour l’essai de flux extracellulaire, des paramètres tels que le nombre de cellules et les concentrations de médicaments ont été testés et optimisés. Par rapport à d’autres méthodes respiratoires, l’analyseur de flux extracellulaire est entièrement automatisé et capable de tester en temps réel, avec de très faibles quantités de cellules, jusqu’à 92 échantillons simultanément, et permet ainsi des dépistages à haut débit (avec plusieurs échantillons et répliques) d’une manière relativement rapide17.

Cette méthode peut être utilisée par des chercheurs intéressés à évaluer la fonction cellulaire NK en étudiant le métabolisme des cellules NK. Il pourrait également être appliqué aux cellules activées par d’autres cytokines, anticorps ou stimuli solubles.

Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux principes éthiques de la recherche médicale énoncés dans la Déclaration d’Helsinki. Des échantillons de sang périphériques provenant de donneurs ont été obtenus auprès du Département de médecine transfusionnelle des NIH en vertu du protocole approuvé par la CISR 99-CC-0168, avec le consentement écrit des patients. 1. Préparation de réactifs Réactifs pour l’isolement des cellules NK…

Representative Results

L’isolement des cellules NK du sang périphérique fournit une population pure et viable L’essai de flux extracellulaire est basé sur la mesure de la concentration de H+ et O2 dans le puits et ne distinguera pas entre les différentes populations de cellules ou leur viabilité. Pour cette raison, l’obtention d’une population très pure et viable de la cellule d’intérêt a été l’étape clé pour réussir dans ces expériences. <p class=…

Discussion

Dans cet article, nous avons établi un protocole pour isoler et cultiver efficacement les cellules NK primaires primaires pures et viables du sang périphérique. Nous avons également optimisé les conditions pour la mesure de l’activité métabolique de ces cellules NK évaluées par le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire en utilisant un analyseur de flux extracellulaire. Par rapport à d’autres méthodes respiratoires, l’analyseur de flux extracellulaire est rapide, n?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le Dr Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) pour leur soutien et leur discussion. Cette étude a été soutenue par les programmes de recherche intra-muros des National Institutes of Health, de l’Institut national du cancer et du National Heart, Lung, and Blood Institute. JT est soutenu par le programme Ramon y Cajal (subvention RYC2018-026050-I) de MICINN (Espagne).

Materials

2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

References

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Cite This Article
Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

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