Summary

Estabilidad y estructura de Murciélago Mayor Histocompatibilidad Complejo Clase I con Heterologous β2-Microglobulina

Published: March 10, 2021
doi:

Summary

El protocolo describe métodos experimentales para obtener sustitutos estables del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase I a través de posibles β sustituciones de2-microglobulina (β2m) de diferentes especies. Se investigó la comparación estructural del MHC I estabilizado por β2m homólogas y heterologosas.

Abstract

El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) desempeña un papel fundamental en la presentación de péptidos de antígeno y las respuestas inmunes a las células T contra las enfermedades infecciosas y el desarrollo tumoral. El MHC híbrido I complejo con β heterologosa2-microglobulina (β2m) sustitución de diferentes especies se puede estabilizar in vitro. Este es un medio factible para estudiar MHC I de mamíferos, cuando el βhomónode 2 m no está disponible. Mientras tanto, se indica que la sustitución de mamíferos β2m no afecta significativamente la presentación de péptidos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología para el MHC I híbrido complejo con heterologous β2-microglobulina (β2m). En este documento, se presentan métodos para evaluar la viabilidad de la sustitución heterologosa βde 2m en el estudio MHC I. Estos métodos incluyen la preparación de construcciones de expresión; purificación de los organismos de inclusión y refolding del complejo MHC; determinación de la termosabilidad proteica; cribado de cristal y determinación de la estructura. Este estudio proporciona una recomendación para entender la función y estructura del MHC I, y también es significativo para la evaluación de la respuesta de las células T durante las enfermedades infecciosas y la inmunoterapia tumoral.

Introduction

El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) existe en todos los vertebrados y es un conjunto de genes que determina la inmunidad mediada por células a patógenos infecciosos. MHC clase I presenta péptidos endógenos, tales como componentes virales producidos sobre la infección por virus, a los receptores de células T (TCR) en la superficie de las células CD8+ T para mediar la inmunidad celular y participar en la regulación inmune1. Un estudio estructural de la unión MHC I a péptidos proporciona información sobre motivos de unión de péptidos y características de presentación de moléculas MHC I, que desempeña un papel vital en la evaluación de las respuestas inmunes a células CD8+ T y el desarrollo de vacunas.

Desde la primera cristalización y determinación estructural del MHC I molecular por Bjorkman et al.2,el análisis de estructura cristalina de moléculas MHC I ha promovido en gran medida la comprensión de cómo los péptidos se unen a las moléculas MHC I, y ayuda a entender la interacción de cadenas ligeras con cadenas pesadas y péptidos. Una serie de estudios de seguimiento indicaron que aunque los genes que codifican la cadena de luz no están asociados con el MHC, la cadena de luz es una proteína clave para el montaje de moléculas MHC I3,4. Interactúa con los tres dominios de las moléculas de clase I de MHC en múltiples superficies. Cuando la cadena de luz está ausente, las moléculas MHC clase I no se pueden expresar correctamente en la superficie de las células que presentan antígenos y no pueden interactuar con TCR para ejercer sus funciones inmunológicas.

MHC I se compone de una cadena pesada (cadena H) y cadena de luz (es decir, β2-microglobulina (β2m)), y se ensambla a través de la unión a un péptido adecuado5. El segmento extracelular de la cadena H consta de α1, α2 y α3 dominios6. Los dominios α1 y α2 forman la ranura de unión de péptidos (PBG). La cadena βde 2m actúa como subunidad estructural del complejo de montaje en MHC I, estabilizando la conformación del complejo, y es una chaperona molecular para la cadena MHC I H plegable7,8,9. Una serie de estudios han demostrado que las cadenas MHC I H de varios mamíferos como murciélago (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10,rhesus macaque (Primates) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, ratón (Rodentia) (H-2Kd)14,15, perro (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, ganado (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 y equino (Periss (Eqca-N*00602 y Eqca-N*00601)18 puede combinarse con β heterologous2m (Tabla 1). Estas moléculas híbridas se utilizan a menudo en estudios estructurales y funcionales. Sin embargo, la metodología para el estudio funcional y estructural del MHC I híbrido con β heterologousde 2m aún no se resume. Mientras tanto, la base estructural para el intercambiado β2m entre diferentes taxones sigue sin estar clara.

En este documento, se resume el procedimiento para la expresión MHC I, la refolding, la cristalización, la recopilación de datos de cristal y la determinación de la estructura. Además, se analizan posibles sustituciones de β2m de diferentes especies comparando la conformación estructural del MHC I estabilizada por β2m. Estos métodos serán útiles para un mayor estudio estructural del MHC I y la evaluación de la respuesta inmune de células T CD8+ en cáncer y enfermedades infecciosas.

Protocol

1. Preparación de construcciones de expresión Recuperar las secuencias de genes de clase I MHC (incluyendo genes predichos) de murciélagos de la base de datos NCBI. Recupere secuencias de cadena pesada MHC I de mamíferos superiores de la base de datos de inmuno polimorfismo (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) y la base de datos UniProt (www.uniprot.org). Para obtener complejos de MHC solubles, mutar las secuencias para eliminar las regiones citosólicas y transmembranas. Clonar los g…

Representative Results

Trabajos anteriores informaron que el péptido HeV1 (DFANTFLP) derivado del HeV fue presentado por Ptal-N*01:0110,19. En este documento seevaluó la capacidad de unión de este péptido a Ptal-N*01:01 con murciélago homólogo β2m (bβ<sub…

Discussion

La construcción de un complejo proteico híbrido a través de la sustitución heterologosa de diferentes taxones es una estrategia común para las investigaciones funcionales y estructurales cuando el complejo homólogo no está disponible, como en el MHC I y sus ligandos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología. En este documento, se analizó la estructura del murciélago MHC I, Ptal-N*01:01, estabilizado por bβ2m o hβ2m. Los aminoácidos clave …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por el fondo abierto del laboratorio clave estatal de Biotecnología Farmacéutica, Universidad Nan-jing, China (Grant no. KF-GN-201905), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 81971501). William J. Liu cuenta con el apoyo del Programa de Jóvenes Científicos Excelentes de la NSFC (81822040) y beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

Materials

10 kDa MMCO membrane Merck millipore PLGC07610
30% Acrylamide LABLEAD A3291-500ml*5
5×Protein SDS Loading Novoprotein PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff Merck millipore UFC901096
Ampicillin Inalco 1758-9314
APS Sigma A3678-100G
BL21(DE3) strain TIANGEN CB105-02
DMSO MP 219605580 Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
DTT Solarbio D1070 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
EDTA-2Na KeyGEN BioTECH KGT515500
Glycerin HUSHI 10010618
GSH Amresco 0399-250G
GSSG Amresco 0524-100G
Guanidine hydrochloride Amresco E424-5KG
hβ2m our lab Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTG Inalco 1758-1400
L-Arginine Hydrochloride Amresco 0877-5KG
NaCl Solarbio S8210
Protein Marker Fermentas 26614
SDS Boao Rui Jing A112130
Superdex Increase 200 10/300 GL GE Healthcare 28990944
TEMED Thermo 17919 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.
Tris-HCl Amresco 0497-5KG
Triton X-100 Bioruler RH30056-100mL
Tryptone Oxoid LP0042
Yeast extract Oxoid LP0021

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Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang, P., Zhang, Q., Liu, P., Zhao, Y., Chai, Y., Lyu, J., Qi, J., Liu, W. J. Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous β2-Microglobulin. J. Vis. Exp. (169), e61462, doi:10.3791/61462 (2021).

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