Summary

Stabilité et structure du complexe histocompatibilité majeur de chauve-souris classe I avec β2-Microglobuline

Published: March 10, 2021
doi:

Summary

Le protocole décrit les méthodes expérimentales pour obtenir stable majeur complexe d’histocompatibilité (MHC) classe I grâce à des substitutions potentielles de β2-microglobuline (β2m) de différentes espèces. La comparaison structurale du MHC I stabilisée par des dommages homologues et β2m ont été étudiées.

Abstract

Le principal complexe d’histocompatibilité (MHC) joue un rôle central dans la présentation du peptide antigène et les réponses immunitaires des cellules T contre les maladies infectieuses et le développement tumoral. Le MHC hybride I complexé d’une substitution β2microglobulines (β2m) de différentes espèces peut être stabilisé in vitro. Il s’agit d’un moyen réalisable d’étudier le MHC I des mammifères, lorsque le β2m n’est pas disponible. Pendant ce temps, il est indiqué que la substitution β2m n’affecte pas significativement la présentation du peptide. Cependant, il y a peu de résumé s’agissant de la méthodologie et de la technologie du MHC hybride I complexés avec des β heterologous2-microglobuline (β2m). Ci-après, des méthodes d’évaluation de la faisabilité d’une substitution β2m dans l’étude MHC I sont présentées. Ces méthodes comprennent la préparation de constructions d’expression; la purification des organismes d’inclusion et le refolding du complexe du CSM; détermination de la thermostabilité des protéines; le criblage en cristal et la détermination de la structure. Cette étude fournit une recommandation pour comprendre la fonction et la structure du MHC I, et est également significative pour l’évaluation de réponse de cellule T pendant la maladie infectieuse et l’immunothérapie de tumeur.

Introduction

Le principal complexe d’histocompatibilité (MHC) existe chez tous les vertébrés et est un ensemble de gènes qui détermine l’immunité à médiatté cellulaire contre les pathogènes infectieux. La classe I du MHC présente des peptides endogènes, tels que des composants viraux produits lors de l’infection virale, aux récepteurs des lymphocytes T (TCR) à la surface des lymphocytes CD8+ T pour jouer le rôle de médiateur de l’immunité cellulaire et participer à la régulationimmunitaire 1. Une étude structurale du MHC I liant aux peptides fournit des informations concernant les motifs de liaison peptidique et les caractéristiques de présentation par les molécules du MHC I, qui joue un rôle vital dans l’évaluation des réponses immunitaires deslymphocytes T CD8 + T et le développement du vaccin.

Depuis la première cristallisation et la détermination structurale du MHC I moléculaire par Bjorkman et coll.2, l’analyse de la structure cristalline des molécules du MHC I a grandement favorisé la compréhension de la façon dont les peptides se lient aux molécules du MHC I, et aide à comprendre l’interaction des chaînes légères avec les chaînes lourdes et les peptides. Une série d’études de suivi ont indiqué que bien que les gènes codant la chaîne lumineuse ne soient pas associés au MHC, la chaîne lumineuse est une protéine clé pour l’assemblage des molécules du MHC I3,4. Il interagit avec les trois domaines des molécules de classe I du MHC sur plusieurs surfaces. Lorsque la chaîne de lumière est absente, les molécules de classe I du MHC ne peuvent pas être correctement exprimées à la surface des cellules présentant des antigènes et ne peuvent pas interagir avec le TCR pour exercer leurs fonctions immunologiques.

Le MHC I est composé d’une chaîne lourde (chaîne H) et d’une chaîne légère (c.-à-d. β2microglobulines (β2m)), et est assemblé par liaison à un peptideapproprié 5. Le segment extracellulaire de la chaîne H se compose de domaines α1, α2 et α36. Les domaines α1 et α2 forment la rainure de liaison peptidique (PBG). La chaîne β2m agit comme une sous-unité structurelle du complexe d’assemblage du MHC I, stabilisant la conformation du complexe, et est un chaperon moléculaire pour le pliage de la chaîne MHC I H7,8,9. Une série d’études ont montré que le MHC I H s’enchaîne chez divers mammifères tels que la chauve-souris (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhésus macaque (Primates) (Mamu-B *17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, souris (Rodentia) (H-2Kd)14,15, chien (Carnivora) (DLA-88*50801)16, bovins (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 et équidés (Periss eqca-N*00602 et Eqca-N*00601)18 peuvent se combiner avec des β heterologousde 2m (tableau 1). Ces molécules hybrides sont souvent utilisées dans des études structurelles et fonctionnelles. Cependant, la méthodologie pour l’étude fonctionnelle et structurale du MHC I hybride avec des β2m n’est pas encore résumée. Pendant ce temps, la base structurelle de l’βde 2m entre les différents taxons reste incertaine.

Dans ce cas, la procédure d’expression, de refolding, de cristallisation, de collecte de données cristallines et de détermination de la structure est résumée. En outre, les substitutions potentielles de β2m de différentes espèces sont analysées en comparant la conformation structurelle du MHC I stabilisée par des β homologues et héterologiques de2m. Ces méthodes seront utiles pour poursuivre l’étude structurale du MHC I et l’évaluation de la réponse immunitaire des lymphocytes T CD8+ T dans le cancer et les maladies infectieuses.

Protocol

1. La préparation de l’expression construit Récupérer les séquences des gènes de classe I du MHC (y compris les gènes prévus) à partir des chauves-souris de la base de données NCBI. Récupérez des séquences de chaînes lourdes MHC I plus élevées à partir de la Base de données sur l’immunomorphisme (DPI) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) et de la base de données UniProt (www.uniprot.org). Pour obtenir des complexes solubles de MHC, mutagenize les séquences pour enlever les régions…

Representative Results

Des travaux antérieurs ont rapporté que le peptide HeV1 (DFANTFLP) dérivé de HeV a été présenté par Ptal-N*01:0110,19. Dans ce cas, la capacité de liaison de ce peptide à Ptal-N*01:01 avec une chauve-souris homologue β2m (bβ2</fon…

Discussion

La construction d’un complexe protéique hybride par substitution héterologique de différents taxons est une stratégie commune pour les investigations fonctionnelles et structurelles lorsque le complexe homologue n’est pas disponible, comme dans le MHC I et ses ligands. Toutefois, il y a peu de résumé s’agissant de la méthodologie et de la technologie. Dans ce cas, la structure de la chauve-souris MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisée par bβ2m ou hβ2m a été analysée. Les acides aminés c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par le fonds ouvert du laboratoire clé d’État de la biotechnologie pharmaceutique, Université de Nan-jing, Chine (Subvention no. KF-GN-201905), la National Natural Science Foundation of China (subventions 81971501). William J. Liu est soutenu par l’Excellent Young Scientist Program de la NSFC (81822040) et beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

Materials

10 kDa MMCO membrane Merck millipore PLGC07610
30% Acrylamide LABLEAD A3291-500ml*5
5×Protein SDS Loading Novoprotein PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff Merck millipore UFC901096
Ampicillin Inalco 1758-9314
APS Sigma A3678-100G
BL21(DE3) strain TIANGEN CB105-02
DMSO MP 219605580 Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
DTT Solarbio D1070 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
EDTA-2Na KeyGEN BioTECH KGT515500
Glycerin HUSHI 10010618
GSH Amresco 0399-250G
GSSG Amresco 0524-100G
Guanidine hydrochloride Amresco E424-5KG
hβ2m our lab Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTG Inalco 1758-1400
L-Arginine Hydrochloride Amresco 0877-5KG
NaCl Solarbio S8210
Protein Marker Fermentas 26614
SDS Boao Rui Jing A112130
Superdex Increase 200 10/300 GL GE Healthcare 28990944
TEMED Thermo 17919 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.
Tris-HCl Amresco 0497-5KG
Triton X-100 Bioruler RH30056-100mL
Tryptone Oxoid LP0042
Yeast extract Oxoid LP0021

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Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang, P., Zhang, Q., Liu, P., Zhao, Y., Chai, Y., Lyu, J., Qi, J., Liu, W. J. Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous β2-Microglobulin. J. Vis. Exp. (169), e61462, doi:10.3791/61462 (2021).

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