Summary

Использование первичных культивированных нейронов гиппокампа для изучения сборки начальных сегментов аксона

Published: February 12, 2021
doi:

Summary

Здесь мы описали протокол количественного изучения сборки и структуры исходных сегментов аксона (AIS) нейронов гиппокампа, в которых отсутствует предварительно собранная АИС из-за отсутствия гигантского анкирина-G.

Abstract

Начальные сегменты аксона нейронов (АИС) являются участками инициации потенциалов действия и были широко изучены на предмет их молекулярной структуры, сборки и пластичности, зависящей от активности. Гигантский анкирин-G, главный организатор АИС, напрямую ассоциируется с мембранными напряжениями закрытого натриевого (VSVG) и калиевого каналов (KCNQ2/3), а также с нейрофасцином 186 кДа, молекулой адгезии клеток L1CAM. Гигантский анкирин-G также связывается и рекрутирует цитоплазматические молекулы АИС, включая бета-4-спектрин, и микротрубочки-связывающие белки, EB1 / EB3 и Ndel1. Гигантского анкирина-G достаточно для спасения образования АИС в нейронах с дефицитом анкирина-G. Анкирин-G также включает меньшую изоформу 190 кДа, расположенную в дендритных шипах вместо АИС, которая не способна нацеливаться на АИС или спасать АИС в нейронах с дефицитом анкирина G. Здесь мы описали протокол с использованием культивируемых нейронов гиппокампа у мышей ANK3-E22/23-flox, которые при трансфекции Cre-BFP демонстрируют потерю всей изоформы анкирина-G и ухудшают образование АИС. Объединив модифицированную систему кокультуры глии и нейронов Банкира, мы разработали метод трансфектации анкирин-G нулевых нейронов с плазмидой 480 кДа анкирин-G-GFP, что достаточно для спасения образования АИС. Мы также используем метод количественной оценки, разработанный Зальцером и его коллегами для борьбы с изменением расстояния АИС от тел нейронных клеток, которое происходит в культурах нейронов гиппокампа. Этот протокол позволяет проводить количественные исследования сборки de novo и динамического поведения АИС.

Introduction

Начальный сегмент аксона расположен в проксимальном аксоне в большинстве нейронов позвоночных. Функционально АИС – это место, где инициируются потенциалы действия из-за высокой плотности натриевых каналов с напряжением в этой области. АИС некоторых возбуждающих нейронов также нацелены на тормозные интернейроны путем образования ГАМКергических синапсов1,2,3. Таким образом, АИС является критическим участком для интеграции клеточной сигнализации и модуляции возбудимости нейронов. АИС обычно составляет 20-60 мкм в длину и расположена в пределах 20 мкм от тела клетки. Длина и положение АИС варьируется в нейронах по областям мозга, а также на разных стадиях развития одного и того женейрона4,5. Накопленные данные свидетельствуют о том, что состав и положение АИС динамичны в ответ на изменение активности нейронов4,5,6,7.

480 кДа анкырин-Г является мастер-организатором АИС. 480 кДа анкирин-G представляет собой мембранно-ассоциированный адапторный белок, который непосредственно связывается с напряжением закрытых натриевых каналов, а также с другими основными белками AIS, включая бета4-спектрин, каналы KCNQ2/3, которые модулируют активность натриевых каналов8,9и 186 кДа нейрофасцина, L1CAM, который направляет ГАМКергические синапсы к AIS2,10. 480 кДа анкирин-G разделяет канонические анкириновые домены, обнаруженные в короткой 190 кДа анкирин-G изоформе (ank repeats, спектрин-связывающий домен, регуляторный домен), но отличаются гигантским экзоном, который встречается только у позвоночных и специфически экспрессируется в нейронах(рисунок 1A)11,12. Специфический домен нейронов анкирин-G (НРД) 480 кДа необходим для формирования АИС12. 190 кДа анкирин-G не способствует сборке АИС и не нацеливает АИС в анкирин-G-нулевых нейронах12. Однако 190 кДа анкирина-Г сосредоточено на АИС, содержащей 480 кДа анкирина-Г12. Эта способность 190 кДа анкирина-G нацеливаться на предварительно собранную АИС нейронов дикого типа была источником путаницы в литературе и замедлила оценку критических специализированных функций 480 кДа анкирина-G в сборке АИС. Поэтому крайне важно изучать сборку АИС в анкирин-G-нулевых нейронах, в которым отсутствует предварительно собранная АИС.

Здесь мы представляем метод изучения сборки и структуры АИС с использованием культивируемых нейронов гиппокампа у мышей ANK3-E22/23-flox, который устраняет все изоформы анкирина-G13 (рисунок 1B). Трансфектируя нейроны с помощью конструкции Cre-BFP до сборки AIS, мы генерировали анкирин-G-дефицитные нейроны, полностью лишенные AIS(рисунок 1B, рисунок 2). Сборка АИС полностью спасена после совместной трансфекции плазмиды анкирин-G-GFP 480 кДа с плазмидой Cre-BFP. Этот метод обеспечивает способ изучения сборки АИС в несборной среде АИС. Мы также модифицировали систему кокультуры глиа-нейрон от Гэри Бэнкера без использования антибиотиков, ранее разработанную для эмбриональных нейронов 18-го дня, для применения к постнатальным нейронам мыши и адаптировали метод количественного определения АИС для усреднения измерений АИС от нескольких нейронов для нормализации вариации АИС14,15.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод культивирования нейронов гиппокампа из постнатальных 0-дневных мышей ANK3-E22/23f/f адаптирован из системы кокультуры глии/нейронов Гэри Банкира. Поэтому крайне важно выполнять все шаги после вскрытия в чистом вытяжке с использованием стерилизованных инст?…

Representative Results

Полный набор эксперимента должен включать только трансфекцию Cre-BFP в качестве отрицательного контроля, Cre-BFP плюс 480 кДа анкирин-G ко-трансфекцию в качестве положительного контроля и неперетерфраженное состояние в качестве контроля техники. В контроле только Cre-BFP трансфектированные ней?…

Discussion

Сборка АИС организована 480 кДа анкырин-Г. Однако анкирин-G имеет более короткие изоформы, которые могут нацеливаться на АИС нейронов дикого типа, что может привести к трудностям в интерпретации структурно-функционального анализа сборки АИС. Здесь мы представляем метод с использованием …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим доктора Гэри Банкира за предложение по протоколу нейронной культуры. Эта работа поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза, грантом NIH и профессорским саном Джорджа Барта Геллера (V.B.).

Materials

10xHBSS Thermo Fisher Scientific 14065-056
18mm coverglass (1.5D) Fisher Scientific 12-545-84-1D
190kDa ankyrin-G-GFP Addgene #31059
2.5% Tripsin without phenol red Thermo Fisher Scientific 14065-056
480kDa ankyrin-G-GFP lab made Provide upon request
ANK3-E22/23f/f mice JAX Stock No: 029797 B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
B27 serum-free supplement Thermo Fisher Scientific A3582801
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Cell strainer with 70-mm mesh BD Biosciences 352350
Ceramic coverslip-staining rack Thomas Scientific 8542E40
Cre-BFP Addgene #128174
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995073
GlutaMAX-I supplement Thermo Fisher Scientific A1286001
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668030
MEM with Earle’s salts and L-glutamine Thermo Fisher Scientific 11095-080
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103-049
Nitric acid 70% Sigma-Aldrich 225711
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985062
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Poly-L-lysine hydrochloride Sigma-Aldrich 26124-78-7
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1310-58-3

References

  1. Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
  2. Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
  3. Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
  4. Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
  5. Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
  6. Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
  7. Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
  8. Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
  9. Cooper, E. C. Made for “anchorin”: Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
  10. Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
  11. Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
  12. Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
  13. Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
  16. Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).

Play Video

Cite This Article
Yang, R., Bennett, V. Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments. J. Vis. Exp. (168), e61411, doi:10.3791/61411 (2021).

View Video