Utilisation de neurones hippocampiques cultivés primaires pour étudier l’assemblage des segments initiaux axonaux

Summary

Ici, nous avons décrit un protocole pour étudier quantitativement l’assemblage et la structure des segments initiaux d’axone (AIS) des neurones hippocampiques qui manquent d’AIS pré-assemblé en raison de l’absence d’un ankyrin-G géant.

Abstract

Les segments initiaux de l’axone neuronal (AIS) sont des sites d’initiation des potentiels d’action et ont été largement étudiés pour leur structure moléculaire, leur assemblage et leur plasticité dépendante de l’activité. L’ankyrine géante-G, le principal organisateur de l’AIS, s’associe directement aux canaux sodique et potassique (VSVG) et à la tension couvrant la membrane (KCNQ2/3), ainsi qu’à la neurofascine 186 kDa, une molécule d’adhésion cellulaire L1CAM. L’ankyrine-G géante se lie également aux molécules d’AIS cytoplasmiques et les recrute, y compris la bêta-4-spectrine, et les protéines de liaison aux microtubules, EB1/EB3 et Ndel1. L’ankyrine-G géante est suffisante pour sauver la formation d’AIS dans les neurones déficients en ankyrine-G. L’ankyrine-G comprend également une isoforme plus petite de 190 kDa située au niveau des épines dendritiques au lieu de l’AIS, qui est incapable de cibler l’AIS ou de sauver l’AIS dans les neurones déficients en ankyrine-G. Ici, nous avons décrit un protocole utilisant les neurones hippocampal cultivés des souris d’ANK3-E22/23-flox, qui, une fois transfected avec cre-BFP montrent la perte de toute l’isoforme de l’ankyrine-G et altèrent la formation d’AIS. Combiné un système modifié de co-culture de glie de Banker/neurone, nous avons développé une méthode pour transfecter des neurones nuls d’ankyrine-G avec un plasmide ankyrine-G-GFP de 480 kDa, ce qui est suffisant pour sauver la formation d’AIS. Nous utilisons en outre une méthode de quantification, développée par Salzer et ses collègues pour traiter la variation de la distance de l’AIS par rapport aux corps cellulaires neuronaux neuronaux qui se produit dans les cultures de neurones de l’hippocampe. Ce protocole permet des études quantitatives de l’assemblage de novo et du comportement dynamique de l’AIS.

Introduction

Le segment initial de l’axone est situé à l’axone proximal dans la plupart des neurones vertébrés. Fonctionnellement, l’AIS est l’endroit où les potentiels d’action sont initiés en raison de la haute densité des canaux sodiques voltage-gated dans cette région. L’AIS de certains neurones excitateurs est également ciblée par des interneurones inhibiteurs par la formation de synapses GABAergiques^1,2,3. Par conséquent, l’AIS est un site essentiel pour intégrer la signalisation cellulaire et moduler l’excitabilité des neurones. L’AIS a normalement une longueur de 20 à 60 μm et se trouve à moins de 20 μm du corps cellulaire. La longueur et la position de l’AIS varient dans les neurones d’une région du cerveau à l’autre, ainsi que dans différents stades de développement du même neurone^4,5. Les preuves accumulées suggèrent que la composition et la position de l’AIS sont dynamiques pour répondre au changement de l’activité neuronale^4,5,6,7.

480 kDa ankyrin-G est le maître organisateur de l’AIS. L’ankyrine-G 480 kDa est une protéine adaptatrice associée à la membrane qui se lie directement aux canaux sodiques voltageogènes ainsi qu’à d’autres protéines AIS majeures, notamment la beta4-spectrine, les canaux KCNQ2/3 qui modulent l’activité des canaux sodiques^8,9et la neurofascine 186 kDa, un L1CAM qui dirige les synapses GABAergiques vers l’AIS^2,10. 480 kDa ankyrine-G partage des domaines canoniques d’ankyrine trouvés dans la courte isoforme ankyrine-G de 190 kDa (répétitions ANK, domaine de liaison à la spectrine, domaine régulateur), mais se distinguent par un exon géant que l’on ne trouve que chez les vertébrés et qui est spécifiquement exprimé dans les neurones(figure 1A)^11,12. Le domaine spécifique du neurone ankyrine-G de 480 kDa (NSD) est requis pour la formation de l’AIS^12. L’ankyrine-G de 190 kDa ne favorise pas l’assemblage d’AIS ni ne cible l’AIS dans les neurones ankyrine-G-null^12. Cependant, 190 kDa d’ankyrine-G est concentré au niveau de l’AIS contenant 480 kDa d’ankyrine-G^12. Cette capacité de l’ankyrine-G de 190 kDa à cibler l’AIS pré-assemblé des neurones de type sauvage a été une source de confusion dans la littérature et a ralenti l’appréciation des fonctions spécialisées critiques de l’ankyrine-G de 480 kDa dans l’assemblage d’AIS. Par conséquent, il est essentiel d’étudier l’assemblage d’AIS dans les neurones ankyrine-G-null qui n’ont pas d’AIS pré-assemblé.

Ici, nous présentons une méthode pour étudier l’assemblage et la structure de l’AIS en utilisant des neurones hippocampiques cultivés à partir de souris ANK3-E22/23-flox qui élimine toutes les isoformes de l’ankyrine-G¹³ (Figure 1B). En transfectant des neurones avec une construction Cre-BFP avant que l’AIS ne soit assemblé, nous avons généré des neurones déficients en ankyrine-G qui manquaient complètement d’AIS(Figure 1B, Figure 2). L’assemblage de l’AIS est entièrement sauvé après co-transfection du plasmide ankyrine-G-GFP de 480 kDa avec un plasmide Cre-BFP. Cette méthode permet d’étudier l’assemblage AIS dans un environnement AIS non pré-assemblé. Nous avons également modifié le système de co-culture glia-neurone de Gary Banker sans utiliser d’antibiotiques, précédemment conçus pour les neurones embryonnaires du jour 18, pour une application aux neurones postnatals de souris et adapté une méthode de quantification AIS pour faire la moyenne des mesures AIS de plusieurs neurones afin de normaliser la variation de l’AIS^14,15.

Protocol

REMARQUE: Cette méthode de culture de neurones de l’hippocampe à partir de souris ank3-E22/23f/f postnatales de 0 jour est adaptée du système de co-culture glie/neurone de Gary Banker. Par conséquent, il est essentiel d’effectuer toutes les étapes après la dissection dans une hotte propre à l’aide d’outils stérilisés. Ce protocole prend jusqu’à 1 mois. Le flux de travail est affiché dans Figure 3. Le protocole suit les directives animales de l’Uni…

Representative Results

Un ensemble complet d’expériences devrait inclure la transfection Cre-BFP seulement comme contrôle négatif, Cre-BFP plus 480 kDa ankyrine-G co-transfection comme contrôle positif et une condition non transfected comme contrôle technique. Dans le contrôle de Cre-BFP uniquement, les neurones transfectés n’ont pas l’accumulation de marqueurs AIS, y compris l’ankyrine-G (ankG), la beta4-spectrine (β4), la neurofascine (Nf) et les canaux sodiques à tension fermée (VSVG) (Figure 4A</stron…

Discussion

L’assemblage de l’AIS est organisé par 480 kDa ankyrine-G. Cependant, l’ankyrine-G a des isoformes plus courtes qui peuvent cibler l’AIS des neurones de type sauvage, ce qui peut entraîner des difficultés dans l’interprétation des analyses structure-fonction de l’assemblage de l’AIS. Nous présentons ici une méthode utilisant des neurones de souris ANK3-E22/23-flox qui permet l’étude de l’assemblage de novo de l’AIS. En transfectant avec Cre-BFP à 3 div, nous éliminons toute…

Materials

10xHBSS	Thermo Fisher Scientific	14065-056
18mm coverglass (1.5D)	Fisher Scientific	12-545-84-1D
190kDa ankyrin-G-GFP	Addgene	#31059
2.5% Tripsin without phenol red	Thermo Fisher Scientific	14065-056
480kDa ankyrin-G-GFP	lab made	Provide upon request
ANK3-E22/23f/f mice	JAX	Stock No: 029797	B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
B27 serum-free supplement	Thermo Fisher Scientific	A3582801
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768
Cell strainer with 70-mm mesh	BD Biosciences	352350
Ceramic coverslip-staining rack	Thomas Scientific	8542E40
Cre-BFP	Addgene	#128174
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995073
GlutaMAX-I supplement	Thermo Fisher Scientific	A1286001
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668030
MEM with Earle’s salts and L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	11095-080
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103-049
Nitric acid 70%	Sigma-Aldrich	225711
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Poly-L-lysine hydrochloride	Sigma-Aldrich	26124-78-7
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3