Una guía de sección, corte y procesamiento de imágenes para adquisición y análisis de muestras óseas corticales de alto rendimiento para Micro-TC sincrotrón
Summary
Empleamos un protocolo geológico (coring) de muestreo para adquirir muestras óseas corticales de tamaño uniforme para experimentos SRμCT desde el aspecto anterior de la femora humana. Este método es mínimamente destructivo, eficiente, resulta en muestras cilíndricas que minimizan los artefactos de imagen de formas de muestra irregulares y mejora la visualización y análisis microarquiitectural.
Abstract
El hueso es un tejido dinámico y mecánicamente activo que cambia de estructura sobre la vida útil humana. Los productos del proceso de remodelación ósea han sido estudiados sustancialmente utilizando técnicas bidimensionales tradicionales. Los recientes avances en la tecnología de imágenes de rayos X a través de tomografía micro-computarizada de escritorio (μCT) y tomografía micro-computarizada de radiación sincrotrón (SRμCT) han permitido la adquisición de escaneos tridimensionales de alta resolución (3D) de un campo de visión más grande (FOV) que otras técnicas de imágenes 3D (por ejemplo, SEM) proporcionando una imagen más completa de las estructuras microscópicas dentro del hueso cortical humano. Sin embargo, la muestra debe centrarse con precisión dentro del FOV para limitar la aparición de artefactos de rayas conocidos por afectar el análisis de datos. Estudios anteriores han reportado la adquisición de bloques óseos rectilíneas de forma irregular que resultan en artefactos de imágenes debido a bordes irregulares o truncamiento de imagen. Hemos aplicado un protocolo de muestreo geológico (coring) para adquirir especímenes de núcleo óseo cortical de tamaño consistente para experimentos SRμCT desde el aspecto anterior de la femora humana. Este método de coring es eficiente y mínimamente destructivo para el tejido. Crea muestras cilíndricas uniformes que disminuyen los artefactos de imagen por naturaleza de ser isométricos durante la rotación y proporcionan una longitud de trayecto uniforme para los haces de rayos X a lo largo del escaneo. El procesamiento de imágenes de datos tomográficos de rayos X de muestras con forma irregular y de cored confirma el potencial de la técnica para mejorar la visualización y el análisis de la microarquitectura ósea cortical. Un objetivo de este protocolo es ofrecer un método confiable y repetible para la extracción de núcleos óseos corticales que es adaptable para varios tipos de experimentos de imágenes óseas de alta resolución. Un objetivo general de la obra es crear una adquisición de hueso cortical estandarizado para SRμCT que sea asequible, consistente y directa. Este procedimiento puede ser adaptado por investigadores en campos relacionados que comúnmente evalúan materiales compuestos duros como antropología biológica, geociencias o ciencias materiales.
Introduction
Con los recientes avances en la tecnología de imágenes, ahora es factible adquirir datos de imágenes de rayos X con muy alta resolución. Los sistemas micro-CT de escritorio (μCT) son el estándar actual para el hueso canceloso por imágenes debido a su naturaleza no destructiva1. Sin embargo, cuando las características microestructurales por imágenes del hueso cortical, el uso de μCT ha sido más limitado. Debido a las restricciones de resolución, los sistemas de escritorio no pueden alcanzar la resolución necesaria para crear imágenes de características microestructurales más pequeñas que los poros corticales, como las lagunas de osteocitos. Para esta aplicación, SRμCT es ideal debido a la mayor resolución de estos sistemas1. Por ejemplo, los experimentos en la Fuente de Luz Canadiense (CLS) en las líneas de haz de imágenes y terapia biomédicas (BMIT)2 han producido imágenes con voxels de hasta 0,9 μm. Estudios previos1,3,4,5 han utilizado esta resolución para adquirir proyecciones y posteriores renderizaciones tridimensionales (3D) a partir de especímenes óseos corticales de huesos largos humanos(Figura 1)para cuantificar la densidad de lacunar de osteocitos4,6,7,8,9 y variación en la forma de lacunar y tamaño3 a lo largo de la vida humana y entre los sexos. Otros estudios han demostrado la presencia de bandas de osteones en humanos10,un fenómeno previamente reconocido como asociado sólo con mamíferos no humanos en la literatura antropológica forense.
Para lograr una resolución excepcional, el haz de rayos X debe centrarse finamente dentro del campo de visión (FOV), que a menudo limita el tamaño máximo de la muestra a unos pocos milímetros de diámetro. Actualmente, no ha habido procedimientos completos y estandarizados descritos en la literatura que describa la adquisición de muestras óseas que cumplan estas restricciones. El centrado de muestras dentro del FOV es fundamental para garantizar que 1) la muestra permanezca centrada a medida que gira 180° durante la toma de imágenes, y 2) artefactos de escaneo son limitados ya que no hay truncamiento de imagen. En otras palabras, ninguna porción de la muestra fuera del FOV interfiere con el haz que entra en su punto focal dentro del FOV. Si esto ocurre, el algoritmo de reconstrucción se ve privado de algunos de los datos de atenuación necesarios para una reconstrucción totalmente correcta. Vale la pena señalar además que los escaneos de 360° (rotación completa) minimizan los efectos del endurecimiento del haz, pero aumentan los artefactos causados por la desalineación y el movimiento de la muestra durante la toma de imágenes. Por lo tanto, mientras que una exploración de 360° normalmente generará datos más limpios, el tiempo de imagen se duplica y por lo tanto se debe abordar un compromiso entre el costo experimental y la calidad de los datos.
Un aspecto importante y a menudo pasado por alto de los experimentos de imágenes óseas es la técnica de preparación de muestras precisa y replicable realizada antes de la exploración. Los estudios que incorporan métodos SRμCT en sus experimentos mencionan brevemente su protocolo de muestreo, pero los autores proporcionan poco o ningún detalle con respecto a la metodología particular utilizada para reunir sus especímenes. Muchos de estos estudios mencionan el corte de bloques óseos rectilíneos de dimensiones arbitrarias, pero generalmente no proporcionan más información sobre las herramientas o materiales de incrustación utilizados3,4,10,11,12,13,14. Algunos investigadores utilizan comúnmente herramientas rotativas portátiles (por ejemplo, Dremel) para eliminar bloques rectilíneas de hueso de una región de interés (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Este método da como resultado muestras de tamaño no uniforme que pueden ser mayores que la FOV, lo que aumenta la probabilidad de artefactos de exploración y truncamiento de imagen. Estos especímenes a menudo requieren más refinación utilizando una sierra de diamantes y obleas de precisión (por ejemplo, Buehler Isomet). La adquisición de muestras con dimensiones coherentes (hasta las dos centésimas/mm) es fundamental para garantizar que los datasets adquiridos sean de la más alta calidad y que los resultados posteriores sean replicables.
La limitada notificación de la metodología de adquisición de muestras añade una capa adicional de dificultad al intentar emplear y/o validar métodos realizados en un estudio anterior. Actualmente, los investigadores deben ponerse en contacto directamente con los autores para obtener más detalles sobre sus procedimientos de muestreo. El protocolo detallado aquí proporciona a los investigadores biomédicos una técnica de muestreo completamente documentada, replicable y rentable. El objetivo principal de este artículo es proporcionar un tutorial completo sobre cómo adquirir muestras de núcleo óseo cortical de tamaño consistente utilizando una prensa de perforación de molino y broca de diamante para la visualización y extracción precisas de datos microarquiitecturales. Este método se modifica a partir de procedimientos utilizados para recoger rutinariamente cilindros uniformes de diámetro pequeño (1-5 mm) de bloques de materiales duros en mecánica de roca de alta presión15,16,17,18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
No ha habido un protocolo integral y estandarizado para adquirir muestras uniformes y cilíndricas de núcleo óseo cortical para imágenes SRμCT de alta resolución con configuraciones limitadas de FOV. El protocolo detallado aquí llena ese vacío proporcionando un tutorial completo sobre cómo adquirir muestras de núcleo óseo cortical de tamaño consistente para imágenes SRμCT y la posterior visualización y extracción precisas de datos microarquiitecturales. Hemos demostrado que nuestro protocolo proporciona un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación descrita en este artículo se realizó en las instalaciones del BMIT en la Fuente de Luz canadiense, que cuenta con el apoyo de la Fundación canadiense para la Innovación, las Ciencias Naturales y el Consejo de Investigación de Ingeniería de Canadá, la Universidad de Saskatchewan, el Gobierno de Saskatchewan, Western Economic Diversification Canada, el Consejo Nacional de Investigación de Canadá y los Institutos Canadienses de Investigación de la Salud. Los autores quisieran agradecer a los científicos de la fuente de luz canadiense, en particular a Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov y Ning Zu por la asistencia en la configuración y solución de problemas de los sistemas de microscopios SkyScan SRμCT y de haz blanco. También queremos agradecer a Beth Dalzell de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida de la Universidad de Toledo y al Dr. Jeffrey Wenstrup de la Universidad Médica del Noreste de Ohio por el acceso a muestras cadavéricas para este estudio. JM Andronowski cuenta con el apoyo de fondos de investigación de puesta en marcha proporcionados por la Universidad de Akron y una beca del Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo de la Justicia en Ciencias Forenses con fines de justicia penal (2018-DU-BX-0188). RA Davis cuenta con el apoyo de una asistente de posgrado proporcionada por la Universidad de Akron. Los equipos y suministros utilizados para el corte y la aserración fueron comprados por fondos de puesta en marcha proporcionados por la Universidad de Akron y la subvención de la NSF EAR-1624242 a CW Holyoke.
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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