同步加速器微CT高通量皮质骨样品采购和分析的剖面、科林和图像处理指南
Summary
我们采用了地质（科灵）采样方案，从人类粪便的前部获取均匀大小的皮质骨标本，用于SRμCT实验。这种方法具有极小的破坏性、有效性，可产生圆柱形标本，最大限度地减少不规则样本形状的成像伪影物，并改进微结构可视化和分析。
Abstract
骨骼是一种动态和机械活性组织，在人的寿命中改变结构。骨骼重塑工艺的产品已经使用传统的二维技术进行了大量研究。通过桌面微计算断层扫描 （μCT） 和同步加速器辐射微计算断层扫描 （SRμCT） 的 X 射线成像技术的最新进展，使得获得比其他 3D 成像技术（例如 SEM） 更大的视野 （FOV） 高分辨率三维 （FOV） 扫描能够更完整地了解人类皮质骨骼内的微观结构。但是，标本应准确以 FOV 为中心，以限制已知影响数据分析的条纹伪影的外观。先前的研究已经报告采购了不规则形状的直线骨块，这些骨块由于边缘不均匀或图像截断而导致成像。我们应用了地质采样协议（科林），从人类粪便的前部获取一致大小的皮质骨芯标本，用于SRμCT实验。这种腐蚀方法效率高，对组织的破坏力极小。它创建均匀的圆柱形样品，可减少在旋转过程中的等轴测量性质的成像伪影物，并在整个扫描过程中为 X 射线束提供均匀的路径长度。对核心和不规则形状样品的X射线断层图像数据的图像处理证实了该技术改进皮质骨微构造的可视化和分析的潜力。该协议的目标是提供一种可靠且可重复的方法，用于提取皮质骨芯，该方法可适应各种类型的高分辨率骨成像实验。这项工作的首要目标是为 SRμCT 创建一个经济实惠、一致且简单明了的标准化皮质骨骼采购。相关领域的研究人员可以进一步调整这一程序，他们通常评估硬复合材料，如生物人类学、地球科学或材料科学。
Introduction
随着成像技术的最新发展，现在以极高的分辨率获取X射线成像数据是可行的。桌面微CT（μCT）系统是目前成像取消骨骼的标准，由于其无损性质1.然而，当皮质骨的显微结构特征成像时，μCT的使用更加有限。由于分辨率限制，桌面系统无法达到比皮质孔隙小的显微结构特征（如骨细胞孔）所需的分辨率。对于此应用，SRμCT 是理想的，因为这些系统的分辨率更高1。例如，加拿大光源 （CLS） 生物医学成像和治疗 （BMIT） 光束线2上的实验产生了体积小至 0.9 μm 的图像。先前的研究1，3，4，5已经利用这个分辨率从人类长骨皮质骨标本（图1）获得投影和随后的三维（3D）渲染，以量化骨细胞拉库纳尔密度4，6，7，8，9和变化的拉库纳尔形状和大小3在整个人类寿命和性别之间。进一步的研究已经证明，在人类10中存在奥斯丁带，这种现象以前在法医人类学文献中只与非人类哺乳动物有关。
为了实现超常的分辨率，X 射线束必须在视野 （FOV） 内进行精细聚焦，这通常将最大标本大小限制在直径几毫米以内。目前，文献中没有描述符合这些限制的骨样采购的全面、标准化的程序。FOV 中的中心标本对于确保 1） 样本在成像过程中旋转 180° 时保持中心位置至关重要，2） 扫描伪影因有限，因为没有图像截断。换句话说，FOV 以外的样品没有部分干扰光束进入 FOV 内部的焦点。如果发生这种情况，重建算法将被剥夺完全正确的重建所需的一些衰减数据。还值得注意的是，360°（全旋转）扫描将光束硬化的影响降至最低，但增加了成像过程中因错位和样品移动而引起的工件。因此，虽然 360° 扫描通常会生成更清洁的数据，但成像时间会翻倍，因此必须解决实验成本和数据质量之间的妥协问题。
骨成像实验的一个重要和经常被忽视的方面是在扫描前进行的准确和可复制的标本准备技术。将SRμCT方法纳入实验的研究简要地提到了他们的采样方案，但作者对收集标本的特定方法几乎没有提供细节。许多此类研究提到任意尺寸的直线骨块切割，但一般不提供有关使用3、4、10、11、12、13、14的工具或嵌入材料的进一步信息。一些研究人员通常使用手持式旋转工具（如Dremel），从感兴趣的区域（ROI）3、4、10、11、12、13、14中去除直线骨块。此方法可产生可能大于 FOV 的非统一大小的样本，增加了扫描工件和图像截断的可能性。此类标本通常需要使用精密的金刚石晶圆锯（例如布勒伊索梅特）进行进一步精炼。采购尺寸一致的样品（达到百分之二百/毫米）对于确保所获取的数据集质量最高且后续结果可复制至关重要。
样本采购方法的有限报告在尝试使用和/或验证先前研究中执行的方法时增加了一层额外的困难。目前，研究人员必须直接与作者联系，了解其取样程序的更多细节。此处详述的协议为生物医学研究人员提供了一种经过全面记录、可复制且经济高效的采样技术。本文的主要目标是提供一个全面的教程，说明如何使用磨钻压机和金刚石芯位采购大小一致的皮质骨芯样品，从而准确可视化和提取微结构数据。这种方法是从高压岩石力学15、16、17、18、19的硬材料块中常规收集均匀小直径（1-5毫米）圆柱体的程序中修改的。
Protocol
Representative Results
Discussion
对于采购具有有限 FOV 设置的高分辨率 SRμCT 成像的均匀和圆柱形皮质骨芯样品，尚未制定全面、标准化的协议。此处详细的协议通过提供有关如何为 SRμCT 成像采购一致大小的皮质骨芯样本以及随后精确可视化和提取微结构数据的全面教程来填补这一空白。我们已经表明，我们的协议提供了一个更标准化和可靠的方法来采购皮质骨芯比以前描述的截断直线骨块的任意尺寸。因此，依靠手持式旋转?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本论文中描述的研究在加拿大光源BMIT设施进行，该设施得到加拿大创新、自然科学和工程研究理事会、萨斯喀彻温大学、萨斯喀彻温省政府、加拿大西部经济多样化、加拿大国家研究理事会和加拿大卫生研究所的支持。作者要感谢加拿大光源公司的光束线科学家，特别是亚当·韦伯、丹尼斯·米勒、谢尔盖·加西洛夫和宁祖在SkyScan SRμCT和白光束显微镜系统的设置和故障排除方面给予的帮助。我们还要感谢托莱多大学医学和生命科学学院的贝丝·达尔泽尔和东北俄亥俄医科大学的杰弗里·温斯特鲁普博士为这项研究获取尸体样本。JM Andronowski通过阿克伦大学和刑事司法法医学国家司法研究与发展研究所提供的启动研究基金（2018-DU-BX-0188）得到支持。RA戴维斯由阿克伦大学提供的研究生助理支持。用于制芯和锯的设备和用品由阿克伦大学提供的启动资金购买，NSF向CW Holyoke提供EAR-1624242。
Materials
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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