Summary

Ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) para la detección específica y rápida del virus del lago Tilapia

Published: May 18, 2020
doi:

Summary

Presentamos un ensayo RT-LAMP para la detección de TiLV en peces de tilapia utilizando instrumentos simples durante un período de tiempo relativamente corto en comparación con las técnicas convencionales rt-PCR. Este protocolo puede ayudar a controlar la propagación epidémica de TiLVD, especialmente en los países en desarrollo.

Abstract

La enfermedad por el virus del lago Tilapia (TiLVD), una enfermedad viral emergente en la tilapia causada por el virus del lago tilapia (TiLV), es un desafío persistente en la industria de la acuicultura que ha dado lugar a la morbilidad masiva y mortalidad de tilapia en muchas partes del mundo. Por lo tanto, es necesario un ensayo diagnóstico eficaz, rápido y preciso para la infección por TiLV para detectar la infección inicial y prevenir la propagación de la enfermedad en la acuicultura. En este estudio, se presenta un método de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) altamente sensible y práctico para detectar el virus del lago tilapia en el tejido de los peces. Una comparación de los ensayos RT-qPCR y RT-LAMP de muestras infectadas reveló resultados positivos en 63 (100%) y 51 (80,95%) muestras, respectivamente. Además, un análisis de muestras no infectadas mostró que los 63 tejidos no infectados arrojaron resultados negativos tanto para los ensayos RT-qPCR como para RT-LAMP. La reactividad cruzada con cinco patógenos en la tilapia se evaluó utilizando RT-LAMP, y todas las pruebas mostraron resultados negativos. Tanto las muestras de hígado como de moco obtenidas de peces infectados mostraron resultados comparables utilizando el método RT-LAMP, lo que sugiere que la mucosidad se puede utilizar en RT-LAMP como un ensayo no letal para evitar la matanza de peces. En conclusión, los resultados demostraron que el ensayo RT-LAMP presentado proporciona un método eficaz para la detección de TiLV en el tejido tilapia dentro de 1 h. Por lo tanto, se recomienda el método como herramienta de cribado en granjas para el diagnóstico rápido de TiLV.

Introduction

La enfermedad por el virus del lago Tilapia (TiLVD) es una enfermedad viral en la tilapia (Oreochromis spp.) que al parecer causa muertes por tilapia en muchas regiones del mundo, incluyendo Asia1,2, Africa, y América. La enfermedad fue reconocida por primera vez durante la mortalidad masiva de tilapia en 2009 en Israel, donde el número de tilapia silvestre en el lago Kinneret se desplomó dramáticamente de 257 a 8 toneladas por año2. La enfermedad es causada por el virus del lago tilapia (TiLV), que ha sido asignado a la familia Amnoonviridae como un nuevo género Tilapinevirus y una nueva especie Tilapia tilapinevirus3. La caracterización genética de TiLV mostró que el virus es un virus de ARN envuelto, de sentido negativo y de una sola cadena que tiene 10 segmentos que codifican 10 proteínas1,2,4. Varias especies de tilapia en el género Sarotherodon, Oreochromis,y Tilapine y otros peces de agua caliente (por ejemplo, gourami gigante (Osphronemus goramy)) han demostrado ser susceptibles a TiLV2,5. Actualmente, este virus continúa propagó globalmente, posiblemente a través del movimiento de peces vivos infectados6,7, mientras que el riesgo de transmisión viral a través de tilapia congelada o su producto es limitado8. La mortalidad sustancial debida a la infección por TiLV tiene el potencial de tener un impacto económico significativamente perjudicial en la industria de la tilapia. Por ejemplo, el impacto económico del síndrome de mortalidad de verano en Egipto asociado con la infección por TiLV se calculó en US$100 millones9. En consecuencia, es importante desarrollar un método de diagnóstico rápido y adecuado para facilitar el control de esta enfermedad en las piscifactorías.

Hasta ahora, el diagnóstico de TiLVD se ha basado en ensayos moleculares, aislamiento viral e histopatología. Se han desarrollado diferentes protocolos e imprimaciones pcR para el diagnóstico TiLV10,,11. Por ejemplo, se ha desarrollado y validado un método de PCR cuantitativo de transcripción inversa basado en verde SYBR (RT-qPCR) con la sensibilidad de detectar tan solo dos copias/L del virus para la deteccióntiLV 10. Otros métodos de PCR para la detección de TiLV incluyen TaqMan cuantitativoPCR 11, RT-PCR2, RT-PCR12anidado y RT-PCR13semianidado. Sin embargo, estos métodos requieren equipos de laboratorio sofisticados y períodos de tiempo relativamente prolongados para producir resultados debido a la complejidad de las reacciones, lo que los hace inadecuados para la aplicación en campo.

El ensayo de amplificación isotérmica (LAMP) mediado por bucle es una aplicación for-field rápida, sencilla y práctica14,15. La técnica emplea el principio de una reacción de desplazamiento de la hebra, mientras que la reacción de amplificación se ejecuta en condiciones isotérmicas sin un sofisticado y costoso ciclor térmico14,,15. En consecuencia, los productos LAMP amplificados o RT-LAMP se analizan en bandas tipo escalera utilizando electroforesis de gel de agarosa con una mancha fluorescente para la visualización segura del ADN o del ARN14 u observación a simple vista para la presencia de turbidez o un precipitado blanco16,,17,,18. Por estas razones, esta técnica se ha utilizado para la detección in situ de diferentes patógenos de peces17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,27. El propósito de este estudio fue establecer un ensayo RT-LAMP rápido, sensible y preciso para la detección de TiLV. El ensayo RT-LAMP ofrece cribado para TiLV en muestras de peces en un plazo de 30 minutos. La técnica se puede aplicar para el diagnóstico y la vigilancia de TiLVD.

Protocol

Este experimento, que implicó el uso de tejido animal, fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Kasetsart, Bangkok, Tailandia (número de protocolo ACKU61-VET-009). 1. Recolección de tejidos Euthanizar pescado de tilapia utilizando una sobredosis de aceite de clavo de olor (es decir, más de 3 ml/L). El metanosulfonato de tricaína se puede utilizar como alternativa al aceite de clavo de olor. Utilice tijeras y fórceps de mayone…

Representative Results

En este estudio, se desarrolló un ensayo RT-LAMP para detectar la infección por TiLV en la tilapia. Las muestras analizadas se recogieron en 14 granjas ubicadas en diferentes partes de Tailandia entre 2015 y 2016. Los peces infectados y no infectados se agruparon principalmente en función de los diagnósticos físicos y la aparición de TiLVD sintomático. La infección por TiLV se confirmó posteriormente utilizando RT-PCR después del proceso de recolección. La electroforesis de gel de agarosa y la detección de un…

Discussion

La industria acuícola está continuamente amenazada por infecciones virales que causan pérdidas económicas sustanciales99,23,,28. Por ejemplo, el emergente TiLV representa una amenaza importante para los países productores de tilapia en muchas partes del mundo1,6,9. Hasta ahora, no ha habido terapias específicas disponibles para pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El proyecto está financiado financieramente por el número de subvención del Fondo de Investigación de Tailandia (TRF) RDG6050078 y el Centro de Estudios Avanzados para la Agricultura y la Alimentación, Instituto de Estudios Avanzados, Universidad Kasetsart, Bangkok, Tailandia en el marco del Proyecto de Promoción de la Investigación de Educación Superior y La Universidad Nacional de Investigación de Tailandia, Oficina de la Comisión de Educación Superior, Ministerio de Educación, Tailandia. La investigación es apoyada en parte por la Beca del Programa de Posgrado de la Escuela de Posgrado de la Universidad de Kasetsart. Los autores quieren agradecer al Dr. Kwanrawee Sirikanchana por la narración que habla del video y a Piyawatchara Sikarin por editar el video.

Materials

Tissue collection:
Clove oil Better Pharma N/A
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) ThermoFisher Scientific Corp. 15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) Geneaid GZR100
Direct-zol RNA Kit: Zymo Research R2071
– Direct-zol RNA PreWash
– RNA Wash Buffer
– DNase/RNase-free water
– Zymo-spin IIICG columns
– Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction buffer Biotechrabbit BR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich 7487-88-9
dNTP set Bioline BIO-39053
Betaine Sigma-Aldrich B2629
Calcein mixture Merck 1461-15-0
Bst DNA polymerase Biotechrabbit BR1101301
AMV reverse transcriptase Promega M510A
Nuclease-free water Invitrogen 10320995
Elite dry bath incubator, single unit Major Science EL-01-220
Gel electrophoresis:
Agarose Vivantis Technologies PC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich SRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
– Tris Vivantis Technologies PR0612-1KG
– Acetic acid (glacial), EMSURE Merck Millipore 1000632500
– Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec Sigma-Aldrich V800170-500G
Neogreen NeoScience Co., Ltd. GR107
DNA gel loading dye (6X) ThermoFisher Scientific Corp. R0611
DNA ladder and markers Vivantis Technologies PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) Bio-Rad 1704487
PowerPac HC power supply Bio-Rad 1645052
Gel Doc EZ System Bio-Rad 1708270
UV sample tray Bio-Rad 1708271
NαBI imager Neogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis Technologies cDSK01 An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) ThermoFisher Scientific Corp. ND-2000
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725120
Nuclease-free water, sterile water MultiCell 809-115-CL
8-tube PCR strips, white Bio-Rad TLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, optical Bio-Rad TCS0803
CFX96 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1855196
General equipment and materials:
Mayo scissors N/A
Forceps N/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer) Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60 LioFuge CM610
Corning LSE mini microcentrifuge Corning 6765
Pipettes Rainin Pipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tips Quality Scientific Plastics TF series
Corning Isotip filtered tips Merck CLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST Wuxi NEST Biotechnology 615601

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Phusantisampan, T., Rawiwan, P., Roy, S. R. K., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus. J. Vis. Exp. (159), e61025, doi:10.3791/61025 (2020).

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