Summary

틸라피아 호수 바이러스의 특이적이고 신속한 검출을 위한 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 분석

Published: May 18, 2020
doi:

Summary

우리는 기존의 RT-PCR 기술에 비해 상대적으로 짧은 기간 동안 간단한 악기를 사용하여 틸라피아 물고기에서 TiLV의 검출을위한 RT-LAMP 분석법을 제시한다. 이 프로토콜은 특히 개발도상국에서 TiLVD의 전염병 확산을 제어하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Abstract

틸라피아 호수 바이러스(TiLVD)는 틸라피아 호수 바이러스(TiLV)에 의한 틸라피아의 새로운 바이러스 질환으로, 전 세계 많은 지역에서 틸라피아의 대량 이환율과 사망률을 초래한 양식 산업에서 지속적인 과제입니다. 따라서 TiLV 감염에 대한 효과적이고 신속하며 정확한 진단 분석법은 초기 감염을 감지하고 양식 농업에서 질병의 확산을 방지하는 데 필요합니다. 본 연구에서, 매우 민감하고 실용적인 역전사 루프 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 방법은 어류 조직에서 틸라피아 호수 바이러스를 검출하기 위해 제시된다. 감염된 샘플의 RT-qPCR 및 RT-LAMP 검문 결과를 비교한 결과 63개(100%)에서 긍정적인 결과가 나타났습니다. 51 (80.95%) 각각 샘플을 채취한다. 더욱이, 감염되지 않은 견본의 분석은 모든 63의 감염되지 않은 조직이 RT-qPCR 및 RT-LAMP 분석결과 둘 다에 대한 부정적인 결과를 산출한다는 것을 보여주었습니다. 틸라피아에 있는 5개의 병원체를 가진 교차 반응성은 RT-LAMP를 사용하여 평가되고, 모든 시험은 부정적인 결과를 보여주었습니다. 감염된 물고기에게서 얻은 간 및 점액 견본 둘 다 RT-LAMP 방법을 사용하여 비교 결과를 보여주었습니다, 점액이 물고기를 죽이는 것을 피하기 위하여 비치명적인 분석으로 RT-LAMP에서 사용될 수 있다는 것을 건의합니다. 결론적으로, 제시된 RT-LAMP 분석법은 1시간 이내에 틸라피아 조직에서 TiLV 검출을 위한 효과적인 방법을 제공한다는 것을 입증하였다. 이 방법은 따라서 TiLV의 신속한 진단을 위한 농장에서 검열 공구로 추천됩니다.

Introduction

틸라피아 호수 바이러스 질환(TiLVD)은 아시아1,2,2아프리카 및 미국을 포함한 세계의 많은 지역에서 틸라피아 사망을 유발하는 틸라피아(Oreochromis spp.)의 바이러스 성 질환이다. 이 질병은 2009년 이스라엘에서 틸라피아의 대량 사망률에서 처음 인식되었으며, 키너렛 호수의 야생 틸라피아 수는 연간 257톤에서8톤으로급격히 감소했습니다 2. 이 질병은 틸라피아 호수 바이러스(TiLV)에 의해 발생하며, 이는 새로운 종인 틸라핀바이러스와 새로운 종틸라피네바이러스3로 가족암누온비리대에 할당되었다. TiLV의 유전적 특성은 바이러스가 10개의 단백질을11,2,,4를인코딩하는 10개의 세그먼트를 가지는 새로운 포위, 음성 감각, 단일 가닥 RNA 바이러스임을 보여주었다. 사로테오돈, 오레오로미스, 틸라핀 및 기타 따뜻한 물 물고기(예를 들어, 거대 가라미(Osphronemusgoramy))의다양한 종은 TiLV2,,5에취약한 것으로 나타났습니다. 현재, 이 바이러스는 감염된 살아있는 물고기의 움직임을 통해 아마도 전 세계적으로 확산계속6,,7,냉동 틸라피아 또는 그 제품을 통해 바이러스 전송의 위험이 제한되는 동안8. TiLV 감염으로 인한 실질적인 사망률은 틸라피아 산업에 상당한 해로운 경제적 영향을 미칠 가능성이 있다. 예를 들어, TiLV 감염과 관련된 이집트의 여름 사망 증후군의 경제적 영향은 미화 1억 달러9로계산되었습니다. 따라서, 어류 양식장에서 이 질병의 통제를 용이하게 하기 위해 신속하고 적절한 진단 방법을 개발하는 것이 중요하다.

지금까지 TiLVD의 진단은 분자 분석, 바이러스 격리 및 조직 병리학에 기반을 두고 있습니다. 다른 PCR 프로토콜 및 프라이머는 TiLV 진단10,,11을위해 개발되었습니다. 예를 들어, 바이러스의 2개의 사본/μL만큼 적은 수의 검출을 위한 민감성을 가진 SYBR 녹색 기반 역전사 정량적 PCR(RT-qPCR) 방법은 TiLV 검출을 위해 개발 및 검증되었다10. TiLV 검출을 위한 다른 PCR 방법은 TaqMan 양적 PCR11,RT-PCR2,중첩 된 RT-PCR12및 반 중첩 된 RT-PCR13을포함한다. 그러나 이러한 방법은 반응의 복잡성으로 인해 결과를 산출하기 위해 정교한 실험실 장비와 비교적 오랜 시간이 필요하므로 현장 적용에 적합하지 않습니다.

루프 매개 등등 증폭(LAMP) 분석은 신속하고 간단하며 실용적인 현장 용 어플리케이션14,,15이다. 이 기술은 가닥 변위 반응의 원리를 채택하고 증폭 반응은 정교하고 고가의 열 사이클러(14,,15)없이등온 조건하에서 실행됩니다. 따라서 증폭된 LAMP 제품 또는 RT-LAMP 제품은 DNA 또는 RNA14의 안전한 시각화를 위해 형광 얼룩을 가진 아가로즈 겔 전기영동을 이용한 사다리형 밴드로 분석되거나 탁도 또는 백색 침전물의 존재에 대한 육안으로관찰16,,17,,18. 이러한 이유로, 이 기술은 상이한 어류 병원체17, 18,,19,,20,,19,21,,22,,23,24,,,25,,26,,27의현장 검출에 사용되어 왔다. 이 연구의 목적은 TiLV 검출을 위한 신속하고 민감하며 정확한 RT-LAMP 분석방법을 확립하는 것이었습니다. RT-LAMP 분석기는 30분 이내에 물고기 샘플에서 TiLV에 대한 스크리닝을 제공합니다. 이 기술은 TiLVD의 진단 및 감시를 위해 적용될 수 있다.

Protocol

동물 조직의 사용을 관련시킨 이 실험은, 카세셋 대학, 방콕, 태국의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 번호 ACKU61-VET-009). 1. 조직 수집 정향 오일의 과다 복용을 사용하여 틸라피아 물고기를 안락사 (즉, 3 mL / L 이상). 트리카인 메탄설포네이트는 정향 오일의 대안으로 사용될 수 있습니다. 멸균 마요네즈 가위와 집게를 사용하여 ?…

Representative Results

이 연구에서는, 틸라피아에서 TiLV 감염을 검출하기 위해 RT-LAMP 분석이 개발되었다. 테스트된 샘플은 2015년과 2016년 사이에 태국의 다른 지역에 위치한 14개의 농장에서 수집되었습니다. 감염되고 감염되지 않은 물고기는 주로 물리적 인 진단과 증상 TiLVD의 출현에 따라 그룹화되었습니다. TiLV 감염은 수집 과정 후 RT-PCR을 사용하여 이후에 확인되었다. 아가로즈 겔 전기동동및 발광 녹색의 검출은 LAM…

Discussion

양식 산업은 지속적으로 상당한 경제적 손실을 일으키는 바이러스 감염에 의해위협9,,,23,28. 예를 들어, 신흥 TiLV는 세계1,,6,,9의많은 지역에서 틸라피아 생산 국가에 큰 위협을 제기한다. 지금까지, TiLVD를 방지 하기 위해 사용할 수 있는 특정 치료 되었습니?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 프로젝트는 태국 연구 기금 (TRF) 교부금 번호 RDG6050078 및 고급 연구 센터, 고급 연구 연구소, 카세차르트 대학, 방콕, 태국 고등 교육 연구 진흥 및 태국 국립 연구 대학 프로젝트, 고등 교육위원회 사무실, 교육청, 태국에 의해 재정적으로 지원됩니다. 이 연구는 카세사르 대학 대학원의 대학원 프로그램 장학금에 의해 부분적으로 지원됩니다. 저자는 비디오의 이야기 말하기에 대한 박사 Kwanrawee 시리칸차나 감사하고 비디오를 편집 피야 와카라 시카린.

Materials

Tissue collection:
Clove oil Better Pharma N/A
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) ThermoFisher Scientific Corp. 15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) Geneaid GZR100
Direct-zol RNA Kit: Zymo Research R2071
– Direct-zol RNA PreWash
– RNA Wash Buffer
– DNase/RNase-free water
– Zymo-spin IIICG columns
– Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction buffer Biotechrabbit BR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich 7487-88-9
dNTP set Bioline BIO-39053
Betaine Sigma-Aldrich B2629
Calcein mixture Merck 1461-15-0
Bst DNA polymerase Biotechrabbit BR1101301
AMV reverse transcriptase Promega M510A
Nuclease-free water Invitrogen 10320995
Elite dry bath incubator, single unit Major Science EL-01-220
Gel electrophoresis:
Agarose Vivantis Technologies PC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich SRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
– Tris Vivantis Technologies PR0612-1KG
– Acetic acid (glacial), EMSURE Merck Millipore 1000632500
– Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec Sigma-Aldrich V800170-500G
Neogreen NeoScience Co., Ltd. GR107
DNA gel loading dye (6X) ThermoFisher Scientific Corp. R0611
DNA ladder and markers Vivantis Technologies PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) Bio-Rad 1704487
PowerPac HC power supply Bio-Rad 1645052
Gel Doc EZ System Bio-Rad 1708270
UV sample tray Bio-Rad 1708271
NαBI imager Neogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis Technologies cDSK01 An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) ThermoFisher Scientific Corp. ND-2000
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725120
Nuclease-free water, sterile water MultiCell 809-115-CL
8-tube PCR strips, white Bio-Rad TLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, optical Bio-Rad TCS0803
CFX96 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1855196
General equipment and materials:
Mayo scissors N/A
Forceps N/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer) Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60 LioFuge CM610
Corning LSE mini microcentrifuge Corning 6765
Pipettes Rainin Pipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tips Quality Scientific Plastics TF series
Corning Isotip filtered tips Merck CLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST Wuxi NEST Biotechnology 615601

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Phusantisampan, T., Rawiwan, P., Roy, S. R. K., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus. J. Vis. Exp. (159), e61025, doi:10.3791/61025 (2020).

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