Summary

Superexpressão retroviral de CXCR4 em células Murine B-1a e transferência adotiva para migração de células B-1a direcionadas para a produção de medula óssea e igM

Published: May 31, 2020
doi:

Summary

Aqui descrevemos um método de superexpressão retroviral e transferência adotiva de células murine B-1a para examinar a migração e localização celular in vivo B-1a. Este protocolo pode ser estendido para diversos ensaios funcionais a jusante, incluindo quantificação da localização celular do doador B-1a ou análise de fatores secretos derivados de células doadoras pós-transferência adotiva.

Abstract

Como a função celular é influenciada por fatores específicos de nicho no microambiente celular, métodos para dissecar a localização e migração celular podem fornecer mais informações sobre a função celular. As células B-1a são um subconjunto exclusivo de células B em camundongos que produzem anticorpos IgM naturais protetores contra epítopos específicos de oxidação que surgem durante a saúde e a doença. A produção de IgM celular B-1a difere dependendo da localização celular B-1a e, portanto, torna-se útil do ponto de vista terapêutico para direcionar a localização B-1a para nichos que apoiam a alta produção de anticorpos. Aqui descrevemos um método para direcionar a migração celular B-1a para a medula óssea por superexpressão mediada retroviral do receptor de quimiocina C-X-C 4 (CXCR4). A indução genética em células murinas primárias B pode ser desafiadora e normalmente produz baixa eficiência de transfecção de 10-20%, dependendo da técnica. Aqui demonstramos que a transdução retroviral das células murinas primárias B-1a resulta em 30-40% de eficiência de transdução. Este método utiliza a transferência celular adotiva de células B-1a transduzidas em camundongos receptores deficientes de células B para que o doador B-1a a migração celular e a localização possam ser visualizadas. Este protocolo pode ser modificado para outros construtos retrovirais e pode ser usado em diversos ensaios funcionais pós-transferência adotiva, incluindo análise de fenótipo e função de células doadoras ou hospedeiras, ou análise de fatores solúveis secretados pós transferência celular B-1a. O uso de camundongos doadores e receptores distintos diferenciados por alótipo CD45.1 e CD45.2 e a presença de um repórter GFP dentro do plasmídeo retroviral também poderia permitir a detecção de células doadoras em outros modelos de camundongos imunes suficientes contendo populações de células B endógenas.

Introduction

Estudos recentes demonstraram células imunes consideráveis, e especificamente células B, heterogeneidade fenotípica e funcional, dependendo da localização celular1,,2,,3,,4,,5. As células B-1a são uma dessas populações com capacidade heterogênea de produzir anticorpos IgM protetores; as células B-1a da medula óssea secretam O IgM de forma constitutiva e contribuem significativamente para os títulos de IgM plasmático6, enquanto as células peritoneal B-1a têm secreção IgM de baixo nível na homeostase e, em vez disso, podem ser ativadas através de receptor inata semelhante ao pedágio (TLR) ou sinalização mediada por citocinas para proliferar rapidamente, migrar e segregar IgM7,8,9,10. Os anticorpos IgM de células B-1a reconhecem epítopos específicos de oxidação (OSE) presentes em patógenos, células apoptóticas e LDL oxidado, e a ligação IgM à OSE pode prevenir a sinalização inflamatória a jusante em doenças como aterosclerose11. Portanto, estratégias para aumentar a produção de IgM através do aumento da migração de células peritoneal B-1a para locais como a medula óssea podem ser terapeuticamente úteis. No entanto, é importante que tais estratégias sejam direcionadas e específicas do tipo celular, pois efeitos fora do alvo podem impactar negativamente a função imunológica ou a saúde.

Aqui descrevemos um método de superexpressão direcionada e de longo prazo do CXCR4 em células murinas primárias B-1a e posterior transferência adotiva para visualizar a migração celular e a produção funcional de anticorpos IgM(Figura 1). A manipulação genética das células B primárias é limitada por baixas eficiências de transfecção em comparação com a transfecção de linhas celulares transformadas. No entanto, como as linhas celulares transformadas podem se desviar significativamente das células primárias12,13, o uso de células primárias provavelmente fornecerá resultados que se alinham mais à fisiologia normal. Várias técnicas foram descritas para transferência genética em células murinas primárias B, incluindo transdução retroviral, transdução adenoviral, lipofecção ou transfecção à base de eletroporação, que têm diferentes níveis de eficiência, transitoriedade e impacto na saúde celular13,,14,,15. O método a seguir utilizou a transdução retroviral, pois produziu eficiência adequada de transferência genética de >30% ao mesmo tempo em que impactou minimamente a viabilidade celular. O retrovírus expresso em CXCR4 foi gerado usando o retroviral descrito anteriormente pelo vírus da célula-tronco murina-proteína fluorescente ribossômica (MSCV-IRES-GFP); MigR1)16, no qual o gene CXCR4 do mouse foi subsla clonado4. As partículas retrovirais MigR1 (controle(Ctl)-GFP) e CXCR4-GFP foram geradas usando transfecção fosfato de cálcio, conforme descrito nos protocolos publicados anteriormente4,,14.

As células B-1a transduzidas com sucesso foram então transferidas por via intravenosa para rag1 deficiente de linfócitos./- camundongos. Ambos os camundongos doadores e receptores também continham o nocaute do gene apolipoproteína E (ApoE), que resulta em aumento do acúmulo de OSE e aterosclerose, fornecendo assim um modelo para ativação celular In vivo B-1 e produção de IgM. Além disso, os camundongos doadores e receptores diferem no aótipo CD45; as células B-1 doadoras vieram de cd45.1+ ApoE-/- camundongos e foram transferidas para rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- receptores. Isso permitiu a diferenciação do CD45.1 do doador das células CD45.2 B receptoras após a transferência sem a necessidade de coloração adicional para marcadores de células B durante a análise da citometria de fluxo. Os resultados aqui fornecidos demonstram que a superexpressão CXCR4 direcionada em células B-1a associa-se ao aumento da capacidade das células B-1a de migrar para a medula óssea, que se associa ao aumento do plasma anti-OSE IgM. Além disso, fornecemos um método para o enriquecimento de células Peritoneal B-1 através da seleção negativa e demonstramos a exigência de ativação celular B-1 para transdução eficiente. Este método pode ser adaptado para outros construtos retrovirais para estudar o efeito da superexpressão proteica na migração celular B-1a, fenótipo ou função. Além disso, o uso da distinção de alótipo CD45.1 versus CD45.2 poderia teoricamente permitir a transferência para outros modelos míopes imunes que contenham células B endógenas.

Protocol

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia. 1. Separação magnética e enriquecimento de células Peritoneal B-1 Eutanize um rato de 12 a 14 semanas, masculino, CD45.1+ApoE-/- mouse usando CO2. Faça um corte superficial no abdômen usando uma tesoura cirúrgica reta e descasque a pele usando uma tesoura curva para expor a parede peritoneal. Flush peritoneal cavity c…

Representative Results

Uma visão geral do protocolo é dada na Figura 1. A Figura 2 apresenta enriquecimento de células peritoneal B-1a após esgotamento magnético de outros tipos de células peritoneal. Células singlet vivas na fração pós-esgotamento têm uma maior proporção de células B CD19+ em comparação com F4/80+ macrófagos, não possuem células CD5hi CD19- T e contêm uma frequência aumentada de células CD19+ CD5m…

Discussion

O método aqui fornecido permite a entrega de genes primários B-1a estáveis e relativamente eficientes, transferência adotiva in vivo e identificação e localização de células injetadas. As células foram capazes de ser detectadas 17 semanas de transferência pós-célula e retiveram o aumento da expressão CXCR4. A entrega mediada pelo retrovírus rendeu 30-40% de eficiência de transdução das células principais murinas B-1a com impacto mínimo na viabilidade celular em nossas mãos(Figura…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projeto 3 de P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) e R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye foi apoiada pela bolsa de pré-doutorado da American Heart Association 16PRE30300002 e 5T32AI007496-20. Agradecemos a Joanne Lannigan, Mike Solga e Claude Chew do Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade da Virgínia por sua excelente assistência técnica.

Materials

70 micron filter caps Falcon 352235
anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc block Life Technologies MFCR00
B220 APC eBioscience 17-0452-83 Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
CD19 APCef780 eBioscience 47-0193-82 Clone: eBio1D3
CD23 biotin eBioscience 13-0232-81 Clone: B3B4
CD23 PECy7 eBioscience 25-0232-82 Clone: B3B4
CD3e biotin eBioscience 13-0033-85 Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- mice N/A N/A Bred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 560580 Clone: A20
CD45.2 BV421 BD Biosciences 562895 Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice N/A N/A Bred in house
CD5 PE eBioscience 12-0051-83 Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirus N/A N/A Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APC eBioscience 17-9991-82 Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirus N/A N/A Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotin Life Technologies MF48015 Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6 Treestar Inc. License required
Gentamicin Gibco 15710-064
Gr-1 biotin eBioscience 13-5931-82 Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serum Gibco 16000-044
HEPES Gibco 15630-080
IgM PECF594 BD Biosciences 562565 Clone: R6-60.2
Insulin syringes BD Biosciences 329461
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405
Live/Dead Yellow Life Technologies L34968
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
NK1.1 biotin BD Biosciences 553163 Clone: PK136
Non-essential amino acids Gibco 11140-050
ODN 1668 InvivoGen tlrl-1668
PBS Gibco 14190-144
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Ter119 biotin eBioscience 13-5921-82 Clone: Ter119

References

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Upadhye, A., Marshall, M., Garmey, J. C., Bender, T. P., McNamara, C. Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production. J. Vis. Exp. (159), e61003, doi:10.3791/61003 (2020).

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