Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.
Da die Zellfunktion von Nischen-spezifischen Faktoren in der zellulären Mikroumgebung beeinflusst wird, können Methoden zur Sezieren von Zelllokalisierung und Migration weitere Einblicke in die Zellfunktion liefern. B-1a-Zellen sind eine einzigartige B-Zell-Untergruppe in Mäusen, die schützende natürliche IgM-Antikörper gegen oxidationsspezifische Epitope produzieren, die während Gesundheit und Krankheit entstehen. Die B-1a-Zell-IgM-Produktion unterscheidet sich je nach B-1a-Zellposition, und daher wird es aus therapeutischer Sicht nützlich, die B-1a-Lokalisierung auf Nischen auszurichten, die eine hohe Antikörperproduktion unterstützen. Hier beschreiben wir eine Methode zur gezielten B-1a-Zellmigration in das Knochenmark durch retroviral-vermittelte Überexpression des C-X-C-Motiv-Chemokinrezeptors 4 (CXCR4). Die Geninduktion in primären murinen B-Zellen kann eine Herausforderung darstellen und führt je nach Technik zu niedrigen Transfektionseffizienzen von 10-20%. Hier zeigen wir, dass die retrovirale Transduktion von primären murinen B-1a-Zellen zu einer Transduktionseffizienz von 30-40% führt. Diese Methode nutzt die Adoptivzellübertragung von transduzierten B-1a-Zellen in B-Zell-mangelhafte Empfängermäuse, so dass spender-B-1a-Zellmigration und -lokalisierung visualisiert werden können. Dieses Protokoll kann für andere retrovirale Konstrukte modifiziert werden und kann in verschiedenen funktionellen Assays nach der Adoption verwendet werden, einschließlich der Analyse des Phänotyps und der Funktion von Spenderzellen oder Wirtszellen oder der Analyse von löslichen Faktoren, die nach der B-1a-Zellübertragung abgesondert werden. Die Verwendung von unterschiedlichen Spender- und Empfängermäusen, die nach CD45.1- und CD45.2-Allotyp unterschieden werden, und das Vorhandensein eines GFP-Reporters innerhalb des retroviralen Plasmids könnten auch den Nachweis von Spenderzellen in anderen, immunreichen Mausmodellen ermöglichen, die endogene B-Zellpopulationen enthalten.
Jüngste Studien haben eine beträchtliche Immunzelle, insbesondere B-Zelle, phänotypische und funktionelle Heterogenität in Abhängigkeit von der Zelllokalisierung1,2,3,4,5gezeigt. B-1a-Zellen sind eine solche Population mit heterogener Fähigkeit, schützende IgM-Antikörper zu produzieren; Knochenmark B-1a-Zellen sezernieren IgM konstitutiv und tragen signifikant zu Plasma-IgM-Titers6bei, während peritoneale B-1a-Zellen bei Homöostase eine niedrige IgM-Sekretion haben und stattdessen durch angeborenen mautähnlichen Rezeptor (TLR) oder zytokinvermittelte Signalisierung aktiviert werden können, um sich schnell zu vermehren, zu migrieren und igM7,8,9,10zu sezernieren. B-1a-Zell-IgM-Antikörper erkennen oxidationsspezifische Epitope (OSE), die auf Krankheitserregern, apoptotischen Zellen und oxidierter LDL vorhanden sind, und IgM-Bindung an OSE kann entzündliche nachgeschaltete Signalisierung bei Krankheiten wie Arteriosklerose verhindern11. Daher können Strategien zur Erhöhung der IgM-Produktion durch erhöhung der peritonealen B-1a-Zellmigration zu Orten wie dem Knochenmark therapeutisch nützlich sein. Jedoch, Es ist wichtig, dass solche Strategien gezielt und zellspezifisch sind, da Off-Target-Effekte die Immunfunktion oder Gesundheit negativ beeinflussen können.
Hier beschreiben wir eine Methode zur gezielten und langfristigen Überexpression von CXCR4 in primären murinen B-1a-Zellen und nachfolgender Adoptivübertragung zur Visualisierung der Zellmigration und der funktionellen IgM-Antikörperproduktion (Abbildung 1). Die genetische Manipulation von primären B-Zellen wird durch niedrige Transfektionseffizienzen im Vergleich zur Transfektion transformierter Zelllinien eingeschränkt. Da transformierte Zelllinien jedoch erheblich von den Primärzellen12,13abweichen können, ist es wahrscheinlich, dass die Verwendung von Primärzellen Ergebnisse liefert, die sich stärker an der normalen Physiologie ausrichten. Mehrere Techniken wurden für den Gentransfer in primären murinen B-Zellen beschrieben, einschließlich retroviraler Transduktion, adenoviraler Transduktion, Lipofektion oder elektroporationsbasierter Transfektion, die unterschiedliche Effizienz, Vergänglichkeit und Auswirkungen auf die Zellgesundheit haben13,14,15. Die folgende Methode nutzte die retrovirale Transduktion, da sie eine ausreichende Genübertragungseffizienz von >30 % bei minimaler Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit ergab. Das CXCR4-exezierende Retrovirus wurde mit dem zuvor beschriebenen retroviralen Konstrukt murinen Stammzellvirus-internen ribosomalen Eintrag site-greenescent Protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, in das das Maus-CXCR4-Gen 4 subkloniert4wurde. MigR1 (Control(Ctl)-GFP) und CXCR4-GFP retrovirale Partikel wurden mit Calciumphosphattransfektion erzeugt, wie in den zuvor veröffentlichten Protokollen4,14beschrieben.
Erfolgreich transduzierte B-1a-Zellen wurden dann intravenös in lymphozyten-defizientenRag1-/- Mäusen übertragen. Sowohl Spender- als auch Empfängermäuse enthielten zusätzlich Knockout des Apolipoproteins E (ApoE)-Gens, was zu einer erhöhten OSE-Akkumulation und Arteriosklerose führt und somit ein Modell für die In-vivo-B-1-Zellaktivierung und IgM-Produktion darstellt. Darüber hinaus unterschieden sich Spender- und Empfängermäuse in CD45-Allotyp; Spender-B-1-Zellen stammten von CD45.1+ ApoE-/- Mäusen und wurden in Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- Empfänger übertragen. Dies ermöglichte die Differenzierung von Spender-CD45.1 von Empfänger-CD45.2-B-Zellen nach der Übertragung, ohne dass b-Zellmarker während der Durchflusszytometrieanalyse zusätzlich gefärbt werden mussten. Die hier bereitgestellten Ergebnisse zeigen, dass die gezielte CXCR4-Überexpression auf B-1a-Zellen mit einer erhöhten Fähigkeit von B-1a-Zellen zur Migration in das Knochenmark assoziiert, was mit erhöhtem Plasma-Anti-OSE-IgM assoziiert. Darüber hinaus bieten wir ein Verfahren zur Anreicherung von peritonealen B-1-Zellen durch negative Selektion an und demonstrieren die Anforderung der B-1-Zellaktivierung für eine effiziente Transduktion. Diese Methode kann für andere retrovirale Konstrukte angepasst werden, um die Wirkung der Proteinüberexpression auf die B-1a-Zellmigration, den Phänotyp oder die Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus könnte die Verwendung von CD45.1 im Vergleich zu CD45.2-Allotyp-Unterscheidung theoretisch den Transfer in andere immunausreichende murine Modelle ermöglichen, die endogene B-Zellen enthalten.
Die hier angebotene Methode ermöglicht eine stabile und relativ effiziente primäre B-1a-Zellgenabgabe, in vivo-Adoptivübertragung sowie die Identifizierung und Lokalisierung der injizierten Zellen. Zellen konnten 17 Wochen nach der Zellübertragung nachgewiesen und eine erhöhte CXCR4-Expression beibehalten werden. Retrovirus-vermittelte Abgabe ergab 30-40% Transduktionseffizienz der primären murinen B-1a-Zellen mit minimalen Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit in unseren Händen (Abbildung…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt von 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Project 3 von P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) und R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye wurde von American Heart Association Pre-Doctoral Fellowship 16PRE30300002 und 5T32AI007496-20 unterstützt. Wir danken Joanne Lannigan, Mike Solga und Claude Chew von der University of Virginia Flow Cytometry Core für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung.
70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |