이 연구의 목표는 성인 심장에서 심근세포를 재현하고 DNA 함량 및 핵형성을 측정하는 방법을 개발하는 것입니다.
성인 포유류 심장은 심근세포, 내피 세포 및 섬유아세포를 포함한 다양한 세포 유형으로 구성됩니다. 조직학적 섹션에서 심근세포핵을 안정적으로 식별하기 어렵기 때문에, 많은 그룹은 면역염색을 수행하기 위해 고정하기 전에 가능한 심근세포분리에 의존합니다. 그러나 이러한 살아있는 심근세포 격리 기술은 최대 최적화에도 불구하고 샘플에서 샘플로의 고유한 변동과 함께 샘플의 수율, 생존 가능성 및 품질을 최대화하기 위해 최적화가 필요합니다. 여기에서, 우리는 개별 심근세포의 생체 내 형태를 보존하면서 최대 수율로 이끌어 내는 심혼의 효소 소화의 앞에 고정을 관련시키는 재현가능한 프로토콜을 보고합니다. 우리는 또한 개별 심근세포에 대한 핵 당 핵과 DNA 함량의 수를 결정하기 위해 자동화 된 분석 플랫폼을 개발했다. 가슴 구멍을 노출 한 후, 심장은 PBS에서 60 mM KCl과 관혈에 의해 diastole에서 체포되었다. 다음으로, 심장은 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 고정된 다음 60 mg/mL 콜라게나제 용액으로 소화하였다. 소화 후, 세포는 트리튜션에 의해 특이화되었고, 심근세포 분획은 차동 원심분리를 통해 농축되었다. 분리된 심근세포는 로포닌 T와 α 액틴을 위해 염색되어 얻은 집단의 순도를 평가하였다. 또한, DAPI 염색 후 심근세포 핵형성 및 계피 상태를 결정하는 영상 분석 플랫폼을 개발했습니다. 이미지 기반 의 ploidy 평가는 일관되고 재현 가능한 결과로 이어졌습니다. 따라서, 이 프로토콜을 통해, 면역세포화학 및 DNA 함량 분석을 허용하기 위해 개별 심근세포의 네이티브 형태를 보존하는 동시에 최대 수율을 달성할 수 있다.
심장 질환은 수십 년 동안 서방 국가의 대다수에서 주요 사망 원인이되었습니다1,,2. 심혈 관 질환의 치료에 많은 개선 은 생존을 향상, 비록 현재 잃어버린 된 심근 세포를 대체 할 수 있는 치료. 따라서 심근 세포 기능, 증식, 세포및 비대와 관련된 연구는 과학 계의 주요 초점이되고 있습니다. 성인 포유류 심장은 연간 1% 미만의 추정 심근세포 재생률을 가진 매우 제한된 재생 능력을 가지고 있기 때문에 심근세포 증식 이벤트3,,4를안정적으로 식별하는 것이 매우 중요합니다. 증식적 사건을 측정하는 대부분의 전략은 이전 또는 현재증식을 평가하기 위해 통합된 DNA 뉴클레오티드 유사체에 대한 염색또는 활성 증식5의핵 마커에 대한 얼룩에 의존한다. 증식성 심근세포의 전체 수가3,,6이너무 낮기 때문에 심근세포 증식 이벤트를 안정적으로 식별하는 것이 특히 중요하다. 예를 들어, 연간 내인성 심근세포의 1% 갱신률을 기준으로, 성인 마우스 심장7,,8에서주어진 시간에 25~50개의 심근세포가 증식될 것으로 예상할 수 있다. 심근 세포 핵의 식별에 있는 어떤 부정확성은 거짓 양성 결과로 이끌어 낼 수 있습니다. 따라서 조직학적 섹션에서 어렵고 신뢰할 수 없는 것으로 입증된 심근세포 핵을 안정적으로 식별하는 것이중요하다. 심근세포의 식별은 조직 단면도보다 단일 세포보다 훨씬 정확하며, PCM1은 조직학적섹션(10)에서심근세포 핵의 신뢰할 수 있는 마커일 수 있지만, α 액틴과 같은 마커를 사용하는 경우에도 다른 세포 유형과 심근세포를 구별하기 어려울 수 있다.
현재 프로토콜은 심근세포의 적어도 30%의 죽음을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 심근세포11의특정 집단의 우발적 인 선택으로 이어질 수 있습니다 고정하기 전에 살아있는 심근구를 분리에 의존한다. 또한 이러한 프로토콜은 재현 가능한 결과를 제공하기 위해 최적화하기가 매우 어렵습니다. 최적화된 절연 기술조차도 일반적으로 다양한 수율12를가진 65% 이하의 살아있는 막대 모양의 심근구를 생성할 수 없습니다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 연구원이 고정 된 심근 세포를 분리 할 수있는 프로토콜을 개발했습니다. 샘플은 격리 전에 고정되기 때문에 수율이 최대화되고 생체 내 형태가 잘 보존됩니다. 더욱이, 이 프로토콜을 사용하면 임상 샘플에서 심근세포들을 분리할 수 있으며, 이는 조달 직후에 일반적으로 고정된다. 더욱이, 새로 생성된 심근세포를 규명하기 위해, 개별 심근세포의 핵형성 및 계피 상태를 측정하는 것이 중요하며, 이는 디플로이드 심근세포들만이 전형적으로 새로 형성되는 것으로 가정되기 때문에 이다. 유동 세포측정은 다중핵을 폴리플로이디로부터 구별할 수 없으며 상대적으로 시간과 자원 집약적인 프로토콜이다. 이미지 내핵의 수동 개요 및 측정은 매우 낮은 처리량이며 인간의 편견에 취약합니다. 고정된 DAPI 염색 심근세포의 이미지를 자동화하여 이러한 두 가지 문제를 모두 해결합니다. 핵 형성 및 ploidy 분포의 이미징 기반 결정은 기본 장비를 사용하여 최소한의 시간과 시약을 얻을 수 있습니다.
심근세포는 문화에서 유지될 수 없기 때문에, 1차 심근세포는 그들의 건축과기능(11)을연구할 수 있도록 분리하는 것이 중요하다. 따라서 심근세포 격리 기술은 심장 장에서 널리 사용되고 있습니다. 목표는 심근 세포의 기능적 측면을 결정하는 경우, 가능한 심근 세포를 분리하는 것이 중요합니다. 이 살아있는 심근세포는 또한 고립된 심근세포에 면역 염색을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그러나, 살아있는 심근세포 분리 기술을 최적화하는 것은 기술적으로 도전적이며, 심지어 최고의 기술은 일반적으로 60-65% 살아있는 막대 모양의 심근세포만 을 산출하고, 나머지 심근세포는 모두11,,12로죽거나 죽어가고 있다. 여기에서, 우리는 연구원이 먼저 심혼을 고치고, 그 때 심근세포를 효율적으로 분리할 수 있는 기술을 개발했습니다. 이 새로운 프로토콜은 이전에 발표된 프로토콜에 비해 막대 모양의 심근세포의 훨씬 더 높은 수율을 허용합니다. 또한, 우리는 핵 형성과 ploidy에 따라 심근세포를 자동으로 분류하는 이미징 분석 플랫폼을 개발했습니다. 이러한 새로운 방법론을 통해, 그룹은 다른 단백질을 위한 심근세포에 얼룩을 내고, 심장의 재생 잠재력을 위한 대리로 심근세포 계측기 및 핵형성 상태를 연구할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 비교적 간단하며 고급 장비 없이 수행할 수 있습니다. 콜라게나아제와 소화를 위한 잠복기의 양은 콜라게나아제 부지에 따라 달라질 수 있으며, 이를 제공하는 회사에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 콜라게나아제 타입 2를 사용했습니다, 이것은 살아있는 심근세포를 얻기 위한 심혼을 소화하기 위하여 가장 널리 이용되기 때문에. 우리의 관측에 근거하여, 우리는 60 mg/mL 콜라게나아제 타입 2를 가진 하룻밤 잠복이 섬유증의 수준에 관계없이 거의 모든 마우스 심혼을 위해 최적이라고 결정했습니다. 우리는 세포내 단백질이 고정되고 세포외 콜라겐만큼 접근하기 때문에 과다 소화의 문제가 없었습니다. 그러나 심장이 제대로 소화되지 않으면 더 격렬한 트리튜레이션이 필요할 수 있으며, 이로 인해 전단 응력으로 인한 세포 단편화가 발생할 수 있습니다. 따라서, 심혼이 trituration으로 이동하기 전에 제대로 소화되는지 확인하는 것이 중요합니다. 심장의 뻣뻣함은 소화 정도를 평가하기 위해 집게로 압박하여 테스트 할 수 있습니다. 콜라게나아제와 함께 배양에 따라, 마음은 덜 뻣뻣하고 찢어 쉽게해야한다. 콜라게나아제의 다른 모형은 또한 이용될 수 있습니다. 이전 보고서는 콜라게나아제 B와 D14의조합을 사용했다.
더욱이, 우리는 이 프로토콜이 심장15에있는 심근세포의 전반적인 수를 평가하기 위하여 이용될 수 있다고 믿습니다. 그러나, 심장으로부터 모든 심근낭을 채취하고 정량화하는 것이 목표라면, 콜라게나아제 용액(예를 들어, 3-7일)에서 오랜 시간 동안 심장을 배양하는 것이 중요하며, 콜라게나제 용액은 하루에 한 번 보충되어야 한다. 이를 통해 심근세포 수율에 대한 트리튜레이션 정도의 영향을 제거하여 격리 효율의 불일치를 최소화할 수 있습니다.
ploidy를 측정하기 위하여 DNA 내용의 사용은 새로운 것이 아닙니다, 수십 년 동안 유동 세포측정에 이용되었습니다. 최근에는 현미경 검사법을 유사하게핵(16)당DNA 함량을 추정하는 데 사용될 수 있는 것으로 나타났다. 여기에서, 우리는 새로 형성된 심근세포에 대한 대리로서 심근세포 핵의 계수를 측정하는 이 전략을 구현했습니다. 심장 재생 분야의 교리는 단핵, 디플로이드 심근세포만 세포균증을 겪고 새로운 심근세포가 생길 수 있다는 것입니다. 생체 내에서 새로운 심근세포 형성을 측정하는 것은 매우 어렵기 때문에 DNA 뉴클레오티드 아날로그의 투여 후 쫓겨난 심근세포를 분리하고 단핵구의 수준을 결정하는 데 매우 도전적이기 때문에, 디플로이드 심근세포는 새로운 심근세포17을생성하는 심장의 능력의 근사치로 사용되어 왔다. 여기에서는 심근세포 계포의 용이한 정량화를 허용하는 ImageJ용 매크로를 제공합니다. 최소한, 500핵은 G1 피크의 위치를 정확하게 추정하기 위해 측정되어야 한다. 염색 및 이미징 조건이 이미지 플레이트의 모든 우물에서 일관되도록 주의를 기울이면 전체 샘플에 걸쳐 500개의 핵만 을 심화해야 하며, 그렇지 않으면 이미지그룹(18,,19)당500개의 핵이 있어야 한다. 핵형성과 계피의 이미징 기반 측정의 한계는 2차원 심분 심근핵으로부터 핵을 구별하는 어려움을 포함한다. 이러한 부착 된 세포는 다핵 세포의 양과 과대 평가될 수 있으며 테트라클로이드 심근세포 핵 집단의 측정 정확도를 감소시킬 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위한 한 가지 가능한 전략은 심근세포 핵 마커 PCM16,,20을사용하는 것이다. 그러나, 우리는 제대로 고정 된 세포 또는 조직에 신뢰할 수있는 PCM1 염색을 얻기 위해 어려움을 겪었습니다.
또 다른 잠재적 인 제한은 일부 핵 얼룩 이미지가 중요한 배경 세포질 얼룩을 가질 수 있다는 것입니다, 광범위한 전처리없이 방법에 내장 피지의 내장을 사용하여 적절한 임계 값을 방지. 또한, 이러한 배경 형광의 불규칙한 기여는 그 정확도를 감소시킨다. 더욱이, 세포가 충분한 시간 동안 DNA 염색 용액에 남아 있지 않으면, 형광염은 핵 내의 포화에 결합되지 않으며 핵 통합 강도와 DNA 함량 사이의 선형 관계의 가정은 더 이상 정확하지 않을 것이다.
소프트웨어가 심근세포 클러스터를 분할할 수 없으며 대신 분석에서 제거할 수 없습니다. 따라서, 상대적으로 낮은 밀도(예를 들어, 1000세포/cm2)에서심근세포를 종자하는 것이 매우 중요하다. 또한, 소프트웨어는 종단 간 및 긴 단수 심근세포에 줄지어 있는 두 개의 심근세포사이를 구별할 수 없다. 이러한 종류의 클러스터는 잘못 팽창 다중 핵 추정을 팽창시킬 수 있습니다.
설명된 방법은 실행 가능한 심근세포를 얻는 것을 허용하지 않으며 따라서 동적 세포 과정을 측정하는 데 사용될 수 없지만, 면역염색을 수행하는 것이 목표라면, 우리는 설명된 방법이 형태및 단백질 국소화 측면에서 심근세포의 높은 수율과 더 나은 품질을 가진 기존 프로토콜보다 우수하다고 믿습니다. 마지막으로, 기술된 방법은 임상샘플(14,,21)으로부터심근세포를 분리하는 데 사용될 수 있다. 우리는 기술된 방법론이 고품질 심근세포를 얻고 새로운 심근세포 대형을 위한 대리로 핵형성 및 ploidy를 측정하는 것을 다른 연구원을 도울 수 있다고 믿습니다.
The authors have nothing to disclose.
JHvB는 NIH, 재생 의학 미네소타, 하트웰 재단의 개별 생물 의학 연구 상으로부터 보조금에 의해 지원됩니다.
96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
Cytation3 | BioTek | – | Used for automated imaging for DNA analysis |
DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | – | Used for analyzing images |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
Nikon A1R HD25 | Nikon | – | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
R | r-project.org | – | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |