这项工作的目标是开发一种方法,从成人心脏中可重复分离心肌细胞,并测量DNA含量和核。
成年哺乳动物心脏由各种细胞类型组成,包括心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。由于难以可靠地识别组织学部分的心肌细胞核,许多组依靠在固定之前隔离可行的心肌细胞进行免疫清除。然而,这些活体心肌细胞分离技术需要优化,以最大限度地提高样品的产量、可行性和质量,尽管最大优化,但样品之间固有的波动。在这里,我们报告一个可重复的协议,涉及在心脏酶消化之前固定,这导致最大产量,同时保持单个心肌细胞的体内形态。我们进一步开发了一个自动化分析平台,以确定单个心肌细胞每个细胞核和DNA含量的数量。在露出胸腔后,心脏在PBS中用60 mM KCl灌注在糖尿病中。接下来,将心脏固定在4%的甲醛(PFA)溶液中,然后用60mg/mL胶原酶溶液消化。消化后,细胞通过三生体化进行奇异化,通过分色离心丰富心肌细胞部分。分离的心肌细胞被染色为特波α T和三种-行为素,以评估获得的人口的纯度。此外,我们开发了一个图像分析平台,以确定心肌细胞核化和DPI染色后倍数状态。基于图像的倍体评估可产生一致且可重现的结果。因此,有了这个协议,可以保留单个心肌细胞的原生形态,从而在达到最大产量的同时进行免疫细胞化学和DNA含量分析。
几十年来,心脏病一直是大多数西方国家的主要,死因。虽然在心血管疾病的治疗的许多改进提高了存活率,但目前没有治疗方法可以取代丢失的心肌细胞。因此,有关心肌细胞功能、增殖、凋亡和肥大的研究一直是并继续是科学界的主要焦点。由于成年哺乳动物心脏的再生能力非常有限,估计心肌细胞的更新率每年不到1%,因此,可靠地识别心肌细胞增殖事件3、4,4至关重要。大多数测量增殖事件的策略要么依靠染色来结合DNA核苷酸类比来评估以前的或目前的增殖,要么依靠活性增殖的核标记的染色5。要可靠地识别心肌细胞增殖事件尤为重要,因为增殖性心肌细胞的总数如此之低,为3,6。,6例如,根据每年1%的内源性心肌细胞的更新率,人们可以预期在成人小鼠心脏7,8的任何给定时间发现25至50个心肌细胞是增殖的。心肌细胞核识别的任何不准确都可能导致误报结果。因此,从组织学第9节中,可靠地识别心肌细胞核至关重要。从单细胞鉴定心肌细胞比从组织部分准确得多,因为即使使用α-actinin等标记物,也很难区分心肌细胞与其他细胞类型,尽管PCM1可能是组织学部分10中心肌细胞核的可靠标记。
目前的协议依赖于在固定之前隔离活心细胞,已知会导致至少30%的心肌细胞死亡,并可能导致无意中选择特定人群的心肌细胞11。此外,这些协议是出了名的难以优化,以提供可重现的结果。即使是优化的分离技术,通常可以产生不超过65%的活的,棒状心肌细胞,产量变化12。
为了克服这些问题,我们开发了一个方案,允许研究人员分离固定心肌细胞。由于样品在分离前是固定的,因此产量最大化,体内形态保存良好。此外,通过此协议,可以分离出心肌细胞与临床样本,这些样本通常在采购后立即固定。此外,为了识别新生成的心肌细胞,测量单个心肌细胞的核和倍体状态非常重要,因为通常只有二倍体心肌细胞才被假定为新形成的。流细胞学不能区分多核和多倍体,是一种相对的时间和资源密集型的协议。图像中核的手动大纲和测量非常低的吞吐量,容易出现人为偏差。固定、隔离的、有偏僻的 DAPI 染色心肌细胞的图像的自动定量解决了这两个问题。基于成像的成核和倍体分布测定,可以用最少的时间和试剂使用基本设备获得。
由于心肌细胞不能在培养中保持,因此分离原发性心肌细胞能够研究其结构和功能11是十分重要的。因此,心肌细胞分离技术在心脏领域得到了广泛的应用。如果目标是确定心肌细胞的功能方面,那么分离可行的心肌细胞就很重要。这些活的心肌细胞也可用于对孤立的心肌细胞进行免疫抑制。然而,优化隔离活体心肌细胞的技术在技术上是具有挑战性的,即使是最好的技术通常也只产生60-65%的活棒状心肌细胞,而其余的心肌细胞都是球状的,死亡或死亡11,12。11,12在这里,我们开发了一种技术,允许研究人员首先修复心脏,然后有效地分离心肌细胞。与之前发布的协议相比,这种新协议允许棒状心肌细胞的产量高得多。此外,我们开发了一个成像分析平台,根据核化和倍体化自动对心肌细胞进行分类。有了这些新方法,组可以染色心肌细胞为不同的蛋白质,并研究心肌细胞倍体和核状态作为代理的心脏再生潜力。
此处描述的协议相对简单,无需任何高级设备即可执行。胶原酶的量和消化的孵育时间可能因胶原酶很多以及提供胶原酶的公司而异。我们使用胶原酶类型2,因为这是最广泛的用于消化心脏获得活的心肌细胞。根据我们的观察,我们确定,与60mg/mL胶原酶2型过夜孵育是几乎所有小鼠心脏的最佳选择,无论纤维化程度如何。我们从来没有过度消化的问题,因为细胞内蛋白质是固定的,不像细胞外胶原蛋白那样容易获得。然而,如果心脏不能正确消化,可能需要更有力的三角,这会导致细胞分裂,由于剪切应力。因此,在进入三角化之前,确保心脏被正确消化是至关重要的。心脏的硬度可以通过用钳子挤压来测试,以评估消化的程度。使用胶原酶孵育后,心脏应不那么僵硬,容易撕裂。其他类型的胶原酶也可以使用。上一份报告使用了胶原酶B和D14的组合。
此外,我们相信,这个协议可以用来评估心脏15的心肌细胞总数。然而,如果目标是从心脏获得和量化所有心肌细胞,重要的是在胶原酶溶液中长期孵育心脏(例如,3-7天),其中胶原酶溶液应每天补充一次。这将通过消除三生体化程度对心肌细胞产量的影响,最大限度地减少隔离效率的不一致。
使用DNA含量测量倍体并不是什么新鲜事,它已被用于流式细胞学几十年。最近,它表明,显微镜同样可以用来估计每核16的DNA含量。在这里,我们实施了这一策略,以测量心肌细胞核的倍体,作为新形成的心肌细胞的代用。心脏再生领域的教条是,只有单核,二倍体心肌细胞可以经历细胞因子,并产生新的心肌细胞。由于测量体内新的心肌细胞形成是非常具有挑战性的,隔离心肌细胞被追逐后,DNA核苷酸模拟和确定单核,二体肌细胞的水平已被用作近似的能力,心脏产生新的心肌细胞17。在这里,我们为 ImageJ 提供了一个宏,它允许对心肌细胞倍体进行简单的定量。在最低限度,必须测量500个原子核,以达到对G1峰值位置的准确估计。如果注意确保染色和成像条件在成像板的每个井中保持一致,则整个样品中只需要成像500个核,否则,每个图像组18、19,需要500个核。在使用二维图像时,基于成像的成核和倍体测量的局限性包括难以区分核与粘附细胞和实际心肌细胞核。这种粘附细胞可能导致高估多核细胞的数量,降低四倍体心肌细胞细胞细胞种群的测量精度。解决这个问题的一个可能策略是使用心肌细胞核标记PCM16,20。6,然而,我们很难在正确固定的细胞或组织上获得可靠的PCM1染色。
另一个潜在的限制是,一些核染色图像可能有显著的背景细胞质染色,防止使用斐济内置的方法,而无需广泛的预处理适当的阈值。此外,这种背景荧光对倍数估计值的不规则贡献降低了其准确性。此外,如果细胞在DNA染色溶液中未留足时间,荧光染料不会与核内的饱和结合,核综合强度与DNA含量之间线性关系的假设将不再准确。
应当指出,软件无法分割心肌细胞聚类,而是将其从分析中删除。因此,以相对较低的密度(例如,1000个细胞/厘米2)播种心肌细胞至关重要。此外,该软件无法区分两个心肌细胞排列到端到端和长,奇异的心肌细胞。这些类型的聚类可能会错误地夸大多核估计值。
虽然所述方法不允许获得可行的心肌细胞,因此不能用于测量动态细胞过程,但如果目标是进行免疫控制,我们相信所述方法优于现有协议,具有更高的心肌细胞产量和更好的质量在形态学和蛋白质定位方面。最后,所述方法可用于从临床样本14、21中分离心肌细胞。我们相信,所述方法可以帮助不同的研究人员获得高质量的心肌细胞,并测量成核和倍体作为新的心肌细胞形成的代理。
The authors have nothing to disclose.
JHvB由美国国家卫生研究所、明尼苏达州再生医学基金会和哈特威尔基金会的生物医学研究奖资助。
96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
Cytation3 | BioTek | – | Used for automated imaging for DNA analysis |
DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | – | Used for analyzing images |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
Nikon A1R HD25 | Nikon | – | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
R | r-project.org | – | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |