Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida
Summary
Este protocolo demuestra métodos para permitir el cultivo in vitro extendido de xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Un paso mejora la viabilidad general de los cultivos de racimos multicelulares en hidrogeles 3D, a través de la eliminación directa de células individuales no viables. Un paso secundario demuestra las mejores prácticas para el cultivo de PDX en una plataforma microfluídica perfundida.
Abstract
Los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), generados cuando el tejido tumoral resecado del paciente se injerta directamente en ratones inmunocomprometidos, permanecen biológicamente estables, preservando así las características moleculares, genéticas e histológicas, así como la heterogeneidad del tumor original. Sin embargo, el uso de estos modelos para realizar una multitud de experimentos, incluyendo la detección de drogas, es prohibitivo tanto en términos de costo como de tiempo. Los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) son ampliamente vistos como plataformas en las que las células cancerosas conservan su integridad biológica a través de interacciones bioquímicas, morfología y arquitectura. Nuestro equipo tiene una amplia experiencia en el cultivo de células PDX in vitro utilizando matrices 3D compuestas de ácido hialurónico (HA). Con el fin de separar las células estromales fibroblastas de ratón asociadas con los PDX, utilizamos el cultivo de rotación, donde las células estromales se adhieren a la superficie de las placas tratadas con cultivo de tejidos mientras flotan las células tumorales PDX disociadas y se autoasocien en cúmulos multicelulares. También flotan en el sobrenadante son células simples, a menudo muertas, que presentan un desafío en la recolección de clústeres PDX viables para la encapsulación aguas abajo en hidrogeles para el cultivo celular 3D. Con el fin de separar estas células individuales de los cúmulos de células vivas, hemos empleado centrifugación de gradiente de paso de densidad. El protocolo descrito aquí permite el agotamiento de células individuales no viables de la población sana de grupos celulares que se utilizarán para la experimentación in vitro. En nuestros estudios, incorporamos los cultivos 3D en placas microfluídicas que permiten la perfusión media durante el cultivo. Después de evaluar los cultivos resultantes utilizando un ensayo de viabilidad basado en imágenes fluorescentes de células purificadas frente a no purificadas, nuestros resultados muestran que este paso de separación adicional redujo sustancialmente el número de células no viables de nuestros cultivos.
Introduction
Durante la última década, el campo de la investigación del cáncer ha demostrado un renovado entusiasmo por los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) como una herramienta para evaluar la dependencia de las vías de las células cancerosas y la susceptibilidad a los medicamentos1. Los modelos PDX más comunes se establecen mediante implantación subcutánea u ortotópica de células tumorales humanas (un fragmento tumoral, un grupo de células derivadas de tumores disociadas o una muestra de células tumorales circulantes aisladas (CTC)) en un huésped de roedores. Si la “toma” tumora tiene éxito, las células del xenoinjerto proliferarán, vascularizarán e interactuarán de otra manera con el tejido huésped para crear un tumor, que puede ser cosechado en un tamaño óptimo, subdividido y reim implantado en otros huéspedes. Entre sus muchas ventajas como sistema modelo, los PDX suelen retener una parte sustancial de la heterogeneidad de la población de células tumorales nativas y permiten evaluar las vías específicas del ser humano y las respuestas celulares2,,3. El contexto in vivo permite la interacción tumoral con vasculatura y otros estroma adyacentes y recapitula características tisulares como la dinámica de difusión de fármacos, la tensión de oxígeno y la matriz extracelular influyen en la progresión tumoral biológica y mecánicamente. Un aspecto negativo de los PDX es su dependencia de un huésped de roedores, tanto para la expansión del tumor como, en última instancia, para las pruebas de hipótesis. Debido a que muchos PDX no pueden adaptarse al cultivo bidimensional tradicional (2D) en el poliestireno del cultivo tisular sin perder muchas de sus características deseables, ha habido un mínimo de terreno medio para los investigadores entre este método in vitro relativamente controlado, y el aumento significativo en los requisitos de gasto, instalaciones y tiempo para el uso de PDX in vivo.
Hemos descrito múltiples modelos in vitro que implementan el cultivo celular 3D dentro de una matriz de apoyo, y recientemente ampliamos ese trabajo para demostrar el cultivo ex vivo de los PDX derivados del cáncer de próstata múltiple (PCa), tanto solos como en co-cultivo con fibroblastos derivados de médula ósea4,,5. Las matrices de hidrogel a base de ácido hialurónico (HA) proporcionan un soporte personalizable y biológicamente relevante para ambos tipos de células, con control fácil sobre las características del hidrogel y claridad óptica para la toma de imágenes a través de la profundidad del hidrogel6.
Los tejidos tumorales PDX maduros comprenden una mezcla variable de células cancerosas humanas heterogéneas y estroma de ratón (fibroblastos, células endoteliales, etc.). Para estudiar las contribuciones específicas de tipo celular a la progresión tumoral in vitro, puede ser ventajoso disociar tumores, separar las poblaciones celulares e incorporarlos experimentalmente de manera organizada para diseccionar vías de comunicación intercelular. Las poblaciones de células mixtas dentro de los digestatos de tejido tienen compatibilidad diferencial con condiciones específicas de cultivo. Por ejemplo, la viabilidad de los fibroblastos asociados al tumor requiere adherencia superficial o matrices 3D funcionalizadas con ligandos de integrina, mientras que las células PDX derivadas de la epitelial no suelen tener estos requisitos, sino que favorecen las interacciones entre células células. Estas diferencias se pueden aprovechar para lograr una separación efectiva de las células PDX de contaminar las células estromales del ratón. El cultivo de rotación de digestatos tisulares permite la adherencia de células estromales a la superficie de cultivo del tejido, mientras que las adherencias de células celulares impulsan las células PDX que flotan sobre la superficie de cultivo giratoria para formar cúmulos multicelulares en el sobrenadante en 24-48 h. Las características específicas de estos racimos varían con el PDX (por ejemplo, racimos grandes, apretados, altamente esféricos o agregados más pequeños y más sueltos que se asemejan a racimos de uva), pero suelen tener tamaños biológicamente relevantes (diámetro de 50 a 250 m), suficiente para evaluar las interacciones celulares que se basan en contactos intercelulares.
La recuperación y el procesamiento de tumores inevitablemente dan lugar a algún grado de muerte celular colateral, ya sea debido a daños a corto plazo por perturbación mecánica/enzimática, o incompatibilidad a largo plazo de subpoblaciones con las condiciones de cultivo elegidas. A pesar de la utilidad del cultivo de rotación como separación a granel inicial, las células muertas o moribundas inevitablemente se transfieren con los clústeres PDX y pueden influir en el cultivo resultante. Estas células muertas son a menudo células PDX individuales que no se integraron en un grupo, fibroblastos estromales de ratón que no pueden sobrevivir en condiciones de cultivo seleccionadas, o particularmente células endoteliales frágiles. Estas células moribundas pueden influir en los resultados experimentales de los “supervivientes” y pueden afectar sustancialmente a la cuantificación, por ejemplo, a través de ensayos de cribado de viabilidad basados en imágenes fluorescentes. Para mejorar la selección de células PDX vivas de este método, adaptamos los métodos de centrifugación con pasos de densidad para eliminar fácilmente las células muertas/moribundas individuales de las mezclas PDX y retener predominantemente cúmulos multicelulares vivos.
Para mejorar el estudio de los clusters derivados de PDX resultantes en el cultivo 3D, utilizamos una plataforma de cultivo de perfusión basada en microfluidos, la OrganoPlate (Figura 1), que es una plataforma de órgano en chip de alto rendimiento que permite el cultivo simultáneo de hasta 96 cultivos 3D perfundidos individuales en una base de microtíter de 384 potes(Figura 1A)7,8. En la placa microfluídica de 2 carriles, un solo chip de tejido está conectado por dos canales microfluídicos(Figura 1B,canal de gel: rojo, canal de perfusión: azul) que abarcan cuatro pozos seguidos. Los dos canales microfluídicos están separados por una cresta de plástico corta llamada Phaseguide que evita el desbordamiento de un canal en su canal vecino adyacente, y simultáneamente permite una interfaz libre de membrana entre el contenido del gel y el canal de perfusión9. Debido a que la parte inferior de la placa microfluídica se compone de vidrio de grado microscopio, los cultivos se pueden ver en la ventana de observación a través de la parte inferior de la placa con un microscopio estándar o automatizado. La perfusión se establece en la placa microfluídica con un balancín programable, utilizando la gravedad para conducir medios a través de los canales microfluídicos, entre pozos de depósito (Figura 1C). El flujo de perfusión-imitación más estrechamente recapitula el microambiente tumoral que el cultivo estático, lo que permite la incorporación de estrés de cizallamiento y una mejor distribución de gases y nutrientes. Los beneficios de mantener un cultivo celular de cáncer perfundido en la placa microfluídica se han descrito previamente como cultivos perfundidos de cáncer de mama exhibieron una viabilidad óptima en comparación con un cultivo estático en 3D de las mismas células7.
El presente informe describe un método de centrifugación de gradiente de densidad adaptado para aislar los racimos de PDX multicelulares en vivo y demuestra su utilidad para establecer cultivos 3D PDX dentro de placas microfluídicas perfuibles. Debido a que un número cada vez mayor de laboratorios de investigación están buscando métodos para facilitar el uso de PDX, anticipamos que los protocolos presentados aquí serán de utilidad inmediata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un método para procesar y cultivar células tumorales derivadas de PDX viables en un sistema de cultivo 3D perfundido y de alto rendimiento. Mientras que este protocolo utiliza tejido PCa PDX, es igualmente eficaz para otros tumores de origen epitelial. Las características tumorales varían entre las líneas PDX individuales incluso dentro del mismo tejido de origen (próstata, mama, etc.). Algunas líneas PCa PDX son más fibrosas y difíciles de aislar las células viables, mientras que otras son m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud del Instituto Nacional del Cáncer SBIR Fase I (HHSN26120700015C) y P01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).
- Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
- Fong, E. L. S., et al. Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).
- Fong, E. L. S., et al. A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions. Biomaterials. 77, 164-172 (2016).
- Engel, B. J., et al. Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures. Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).
- Lanz, H. L., et al. Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform. BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).
- Wevers, N. R., et al. High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform. Scientific Reports. 6, 38856 (2016).
- Vulto, P., et al. Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying. Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).
- Patru, C., et al. CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors. BMC Cancer. 10, 66 (2010).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).
