Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada
Summary
Este protocolo demonstra métodos para permitir a cultura in vitro estendida de xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Um passo aumenta a viabilidade geral das culturas de cluster multicelulares em hidrogéis 3D, através da remoção direta de células únicas não viáveis. Um passo secundário demonstra as melhores práticas para a cultura PDX em uma plataforma microfluida perfumada.
Abstract
Os xenoenxertos derivados do paciente (PDX), gerados quando ressecados do tecido tumoral do paciente são grafados diretamente em camundongos imunocomprometidos, permanecem biologicamente estáveis, preservando características moleculares, genéticas e histológicas, bem como a heterogeneidade do tumor original. No entanto, usar esses modelos para realizar uma infinidade de experimentos, incluindo a triagem de medicamentos, é proibitivo tanto em termos de custo quanto de tempo. Sistemas de cultura tridimensional (3D) são amplamente vistos como plataformas nas quais as células cancerígenas retêm sua integridade biológica através de interações bioquímicas, morfologia e arquitetura. Nossa equipe tem ampla experiência em cultivo de células PDX in vitro usando matrizes 3D compostas de ácido hialurônico (HA). A fim de separar as células estromais do fibroblasto do camundongo associadas aos PDXs, usamos cultura de rotação, onde células estromais aderem à superfície das placas tratadas pela cultura tecidual enquanto células tumorais PDX dissociadas flutuam e se associam a aglomerados multicelulares. Também flutuando no supernante estão células solteiras, muitas vezes mortas, que representam um desafio na coleta de agrupamentos PDX viáveis para encapsulamento a jusante em hidrogéis para cultura celular 3D. Para separar essas células únicas de aglomerados de células vivas, empregamos centrifugação gradiente de passo de densidade. O protocolo aqui descrito permite o esgotamento de células únicas não viáveis da população saudável de aglomerados celulares que serão usados para mais experimentações in vitro. Em nossos estudos, incorporamos as culturas 3D em placas microfluidas que permitem a perfusão da mídia durante a cultura. Depois de avaliar as culturas resultantes usando um ensaio de viabilidade baseado em imagem fluorescente de células purificadas versus não purificadas, nossos resultados mostram que essa etapa de separação adicional reduziu substancialmente o número de células não viáveis de nossas culturas.
Introduction
Na última década, o campo da pesquisa sobre o câncer demonstrou um entusiasmo renovado pelos xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) como uma ferramenta para avaliar a dependência da via celular do câncer e a suscetibilidade de medicamentos1. Os modelos PDX mais comuns são estabelecidos pela implantação subcutânea ou ortotópica de células tumorais humanas — um fragmento de tumor, um conjunto de células derivadas de tumor dissociados ou uma amostra de células tumorais circulantes isoladas (CTCs) — em um hospedeiro de roedores. Se o tumor “tomar” for bem sucedido, as células de xenoenxerto se proliferarão, vascularizarão e interagirão com o tecido hospedeiro para criar um tumor, que pode ser colhido em um tamanho ideal, subdividido e reimplantado em outros hospedeiros. Entre suas muitas vantagens como sistema modelo, os PDXs normalmente retêm uma parcela substancial da heterogeneidade da população de células tumorais nativas e permitem a avaliação de vias específicas humanas e respostas celulares2,,3. O contexto in vivo permite a interação tumoral com vasculatura e outros estroma adjacentes e recapitula características teciduais, como dinâmica de difusão de drogas, tensão de oxigênio e influência de matriz extracelular que impacta biologicamente e mecanicamente a progressão do tumor. Um aspecto negativo dos PDXs é sua dependência de um hospedeiro roedor, tanto para expansão do tumor quanto, em última instância, para testes de hipóteses. Como muitos PDXs não conseguem se adaptar à cultura bidimensional tradicional (2D) no poliestireno da cultura tecidual sem perder muitas de suas características desejáveis, houve um meio termo mínimo para os pesquisadores entre este método in vitro relativamente controlado, e o aumento significativo dos requisitos de despesas, instalações e tempo para o uso in vivo do PDX.
Descrevemos vários modelos in vitro que implementam a cultura celular 3D dentro de uma matriz de apoio, e recentemente expandimos esse trabalho para demonstrar a cultura ex vivo de PDXs derivados de múltiplos câncer de próstata (PDXs) derivados, tanto sozinhos quanto em co-cultura com fibroblastos derivados da medula óssea4,,5. As matrizes de hidrogel baseadas em ácido hialurônico (HA) fornecem suporte personalizável e biologicamente relevante para ambos os tipos de células, com controle fácil sobre características de hidrogel e clareza óptica para imagem através da profundidade do hidrogel6.
Os tecidos tumorais PDX maduros compreendem uma mistura variável de células cancerígenas humanas heterogêneas e estroma de camundongos (fibroblastos, células endoteliais, etc.). Para estudar contribuições específicas do tipo celular para a progressão do tumor in vitro, pode ser vantajoso para dissociar tumores, separar as populações celulares e incorporá-los experimentalmente de forma organizada para dissecar caminhos da comunicação intercelular. As populações de células mistas dentro dos digestados teciduais têm compatibilidade diferencial com condições específicas de cultura. Por exemplo, a viabilidade do fibroblasto associado ao tumor requer a adesão à superfície ou matrizes 3D funcionalizadas com ligantes integrin, enquanto as células PDX derivadas da epitelial não costumam ter esses requisitos, em vez de favorecer interações célula-células. Essas diferenças podem ser exploradas para alcançar a separação efetiva das células PDX da contaminação das células estromais do rato. A cultura de rotação dos digestatos teciduais permite a adesão das células estrois à superfície da cultura tecidual, enquanto as aderências das células celulares impulsionam as células PDX flutuando acima da superfície da cultura rotativa para formar aglomerados multicelulares no supernante em 24-48 h. As características específicas desses clusters variam com o PDX (por exemplo, grandes, apertados, altamente esféricos ou agregados menores e mais soltos que se assemelham a cachos de uvas), mas são tipicamente de tamanhos biologicamente relevantes (50-250 μm de diâmetro), suficientes para avaliar interações celulares que dependem de contatos intercelulares.
A recuperação e o processamento do tumor inevitavelmente resultam em algum grau de morte celular colateral, seja devido a danos a curto prazo causados por interrupção mecânica/enzimática, ou incompatibilidade a longo prazo das subpopulações com as condições de cultura escolhidas. Apesar da utilidade da cultura de rotação como uma separação em massa inicial, células mortas ou moribundas são inevitavelmente transferidas com os clusters PDX e podem influenciar a cultura resultante. Essas células mortas são muitas vezes células PDX individuais que não foram integradas em um aglomerado, fibroblastos estromamais de camundongos que não podem sobreviver em condições de cultura selecionadas, ou células endoteliais particularmente frágeis. Essas células moribundas podem influenciar resultados experimentais de “sobreviventes” e podem impactar substancialmente a quantificação, por exemplo, através de ensaios de triagem de viabilidade fluorescentes baseados em imagem. Para melhorar a seleção de células PDX vivas a partir deste método, adaptamos métodos de centrifugação com passos de densidade para remover facilmente células mortas/moribundas individuais de misturas PDX e reter aglomerados multicelulares predominantemente vivos.
Para aprimorar o estudo de clusters derivados do PDX resultantes na cultura 3D, utilizamos uma plataforma de cultura de perfusão baseada em microfluidos, a OrganoPlate (Figura 1), que é uma plataforma de órgão-sobre-chip de alta produtividade que permite uma cultura simultânea de até 96 culturas 3D perfumadas e individuais em uma base de placas de microtiter de 384 poços(Figura 1A)7,,8. Na placa microfluida de 2 pistas, um único chip de tecido é conectado por dois canais microfluidos (Figura 1B, canal de gel: vermelho, canal de perfusão: azul) que abrangem quatro poços seguidos. Os dois canais microfluidos são separados por uma pequena crista de plástico chamada Phaseguide que impede o transbordamento de um canal em seu canal vizinho adjacente, e simultaneamente permite uma interface livre de membrana entre o conteúdo do gel e do canal de perfusão9. Como a parte inferior da placa microfluiida é composta de vidro de microscópio, as culturas podem ser vistas na janela de observação através da parte inferior da placa com um microscópio padrão ou automatizado. A perfusão é estabelecida na placa microfluida com um roqueiro programável, utilizando gravidade para conduzir a mídia através dos canais microfluidos, entre poços de reservatórios(Figura 1C). A imitação do fluxo de perfusão recapitula mais de perto o microambiente tumoral do que a cultura estática, permitindo a incorporação do estresse da cisalhamento e maior distribuição de gases e nutrientes. Os benefícios da manutenção de uma cultura de células cancerígenas perfumadas na placa microfluida foram descritos anteriormente como culturas de câncer de mama perfundidas apresentaram viabilidade ideal em comparação com uma cultura estática 3D das mesmas células7.
O presente relatório descreve um método de centrifugação de gradiente de densidade adaptada para isolar clusters PDX multicelulares vivos e demonstra sua utilidade no estabelecimento de culturas PDX 3D dentro de placas microfluidas perfusíveis. Como um número crescente de laboratórios de pesquisa está buscando métodos para facilitar o uso do PDX, prevemos que os protocolos aqui apresentados serão de utilidade imediata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um método para processar e cultivar células tumorais viáveis derivadas de PDX em um sistema de cultura 3D de alta produtividade e perfundido. Embora este protocolo utilize tecido PDX PCa, é igualmente eficaz para outros tumores derivados da epitelial. As características tumorais variam entre linhas PDX individuais mesmo dentro do mesmo tecido de origem (próstata, mama, etc.). Algumas linhas PDX são mais fibrosas e difíceis de isolar células viáveis, enquanto outras são mais celulares. O tamanh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde National Cancer Institute Fase I (HHSN26120700015C) e P01CA098912.
Materials
| 1N NaOH | any suitable tissue culture grade | ||
| 60 mm round tissue culture dishes | any suitable | ||
| 6-well tissue culture plates | any suitable | ||
| 70 µm cell strainers | Corning | 431751 | or equivalent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes | or equivalent |
| Density gradient centrifugation solution | Millipore Sigma | P1644 | Percoll |
| Dimethylsulfoxide | any suitable tissue culture grade | ||
| Dissociation enzyme solution | StemCell Technologies | 07921 | ACCUMAX |
| DMEM-F12 | ThermoFisher Scientific | 11039021 | or equivalent |
| Forceps | any suitable | ||
| HA hydrogel kit | ESI BIO | GS311 | HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA) |
| Hanks Balanced Salt Solution | Lonza | 10-527F | or equivalent |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B Hausser BrightLine | or equivalent |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H1398 | or equivalent |
| Image processing software | Oxford Instruments | Imaris 9.3 | or equivalent |
| LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1) | ThermoFisher Scientific | L3224 | or equivalent |
| Microfluidic culture plate | Mimetas | 9603-400-B | 2-lane OrganoPlate |
| Microscope | Nikon | A1R | or equivalent |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000036 | or equivalent |
| PDX-derived tumor tissue | obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host | ||
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | or equivalent |
| Perfusion rocker | Mimetas | OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | |
| pH strips (pH 5-9) | any suitable | ||
| Phosphate-buffered saline solution | Lonza | 17-516F | or equivalent |
| Razor blades | any suitable | ||
| Rotating xy-shaker | VWR | Advanced 3500 Orbital Shaker | or equivalent |
| Scalpel handle | any suitable | ||
| Single channel repeating pipette | Eppendorf | 22260201 | |
| Sterile, 15mL conical centrifuge tubes | any suitable | ||
| Sterile, 50mL conical centrifuge tubes | any suitable |
References
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