Utilisation combinée des essais de métastases de veine de queue et de l'imagerie in vivo en temps réel pour quantifier la colonisation métastatique et le fardeau du cancer du sein dans les poumons
Summary
L’approche décrite combine des tests expérimentaux de métastaser de veine de queue avec l’imagerie animale vivante in vivo pour permettre la surveillance en temps réel de la formation et de la croissance de métastes de cancer du sein en plus de la quantification du nombre et de la taille des métastes dans les poumons.
Abstract
La métastase est la principale cause de décès liés au cancer et il existe peu d’options thérapeutiques pour les patients atteints de maladie métastatique. L’identification et l’essai de nouvelles cibles thérapeutiques qui faciliteront le développement de meilleurs traitements pour la maladie métastatique exigent des modèles précliniques in vivo. Démontré ici est un modèle de souris syngénéique pour assainer la colonisation métastatique de cancer du sein et la croissance suivante. Les cellules cancéreuses métastatiques sont traitées de façon stable avec des vecteurs viraux codant la luciferase firefly et les protéines ZsGreen. Les gènes candidats sont ensuite manipulés de façon stable dans les cellules cancéreuses exprimant la luciferase/ZsGreen, puis les cellules sont injectées chez la souris par l’intermédiaire de la veine latérale de la queue pour mettre en évidence la colonisation et la croissance métastatiques. Un dispositif d’imagerie in vivo est ensuite utilisé pour mesurer la bioluminescence ou la fluorescence des cellules tumorales chez les animaux vivants afin de quantifier les changements dans la charge métastatique au fil du temps. L’expression de la protéine fluorescente permet de quantifier le nombre et la taille des métastases dans les poumons à la fin de l’expérience sans avoir besoin de sectionnement ou de coloration histologique. Cette approche offre un moyen relativement rapide et facile de tester le rôle des gènes candidats dans la colonisation et la croissance métastatiques, et fournit beaucoup plus d’informations que les tests traditionnels de métastase de veine de queue. En utilisant cette approche, nous montrons que le renversement simultané de la protéine associée Oui (YAP) et du co-activateur transcriptionnel avec un motif liant PDZ (TAZ) dans les cellules cancéreuses du sein conduit à une réduction de la charge métastatique dans les poumons et que cette charge réduite est le résultat d’une colonisation métastatique considérablement altérée et d’une croissance réduite des métastases.
Introduction
Le cancer reste la deuxième cause de décès dans le monde1 et la métastes est responsable de la majorité de ces décès2,3. Cependant, une compréhension limitée des mécanismes moléculaires qui régissent la colonisation métastatique et la croissance subséquente a entravé le développement de traitements efficaces pour la maladie métastatique. L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques nécessite un essai pour tester comment l’expression ou la fonction perturbée d’un gène candidat influence la formation et la croissance de métastes. Bien que les modèles de souris autochthonous aient leurs avantages, ils sont longs et coûteux à générer, ce qui les rend plus adaptés à la validation des cibles plutôt qu’à la découverte de cibles. Les systèmes de modèle de transplantation dans lesquels le gène candidat est perturbé dans les cellules cancéreuses in vitro et puis les effets sur le potentiel métastatique sont évalués in vivo, sont moins chers et plus élevés que les modèles autochthonous. En outre, les vecteurs viraux pour l’administration stable de l’ARNi, du CRISPR/CAS9 et des transgènes sont largement disponibles, ce qui rend relativement facile de perturber pratiquement n’importe quel gène ou gène d’intérêt dans une lignée de cellules cancéreuses. Cette approche peut également être utilisée pour évaluer le rôle des gènes candidats dans la colonisation métastatique et la croissance des lignées cellulaires cancéreuses humaines en transplantant les cellules chez des souris immunodéprimées ou humanisées.
Les deux types d’essais utilisés pour tester la formation de métastes par les cellules cancéreuses transplantées in vivo sont les tests spontanés de métastes et les essais expérimentaux de métastes. Dans les essais spontanés de métastes4,5, les cellules cancéreuses sont injectées chez les souris, permis de former une tumeur primaire, puis la formation spontanée de métastes et la croissance ultérieure sont astorées. La force de ce modèle est que les cellules doivent compléter toutes les étapes du processus métastatique afin de former des tumeurs métastatiques. Cependant, beaucoup de lignes de cellules cancéreuses ne métastasent pas efficacement dans les modèles spontanés de métastase, et n’importe quelle manipulation des cellules qui influence la croissance primaire de tumeur peut confondre les résultats de l’analyse de métastase. Des tests expérimentaux de métastes, dans lesquels les cellules cancéreuses sont injectées directement dans la circulation, sont utilisés pour éviter ces pièges. Les essais expérimentaux communs de métastes incluent l’injection de veine de queue6,7,8 (et démontrée ici), l’injection intracardiaque9,et l’injection de veine de portail10.
Le but du protocole présenté ici est de fournir un test de métastes expérimentales in vivo qui permet à un chercheur de surveiller la formation et la croissance des métastes en temps réel, ainsi que de quantifier le nombre et la taille des métastes des points d’extrémité dans les poumons d’une même souris. Pour ce faire, les essais expérimentaux traditionnels de métastes de veine de queue6,7,8 sont combinés avec l’imagerie animale vivante, utilisant un dispositif d’imagerie in vivo9,11,12,13,14. Les cellules tumorales exprimant de façon stable à la fois la luciferase et une protéine fluorescente sont injectées chez les souris par l’intermédiaire de la veine latérale de la queue, puis le dispositif d’imagerie in vivo est utilisé pour mesurer les changements de la charge métastatique dans les poumons au fil du temps (Figure 1). Cependant, le dispositif d’imagerie animale vivante in vivo ne peut pas distinguer ou mesurer la taille des métastases individuelles. Ainsi, à la fin de l’expérience, un stéréomicroscope fluorescent est utilisé pour compter le nombre et mesurer la taille des métastases fluorescentes dans les poumons sans avoir besoin de sectionnement et d’histologie ou d’immunohistochimie (Figure 1). Ce protocole peut être utilisé pour tester comment la modification de l’expression ou de la fonction d’un gène candidat influence la formation et la croissance des métastes. Des composés thérapeutiques potentiels tels que de petites molécules ou des anticorps bloquant la fonction peuvent également être testés.
Pour démontrer cette approche, nous avons d’abord effectué une expérience de preuve de concept dans laquelle le facteur essentiel de réplication, la protéine de réplication A3 (RPA3) est renversé dans les cellules métastatiques de cancer du sein de souris. Nous montrons que les souris injectées avec rpA3 knockdown cellules ont beaucoup moins de charge métastatique à chaque moment par rapport aux souris injectées avec des cellules témoins. L’analyse des poumons métastases-contenants montre que ce fardeau métastatique réduit est le résultat de la colonisation métastatique sensiblement réduite et de la croissance altérée des métastases qui se forment. Pour démontrer davantage cette technique, nous avons examiné si l’élimination simultanée de la protéine associée Oui (YAP) et du co-activateur transcriptionnel avec un motif de liaison PDZ (TAZ) altère la colonisation métastatique ou la croissance ultérieure. YAP et TAZ sont deux co-activateurs transcriptionnels connexes qui sont les effecteurs critiques en aval de la voie hippopotame. Nous15,16 et d’autres ont impliqué YAP et TAZ dans la métastasie (revue en17,18,19), suggérant que ces protéines sont de bonnes cibles thérapeutiques. Constamment, nous avons constaté que les souris injectées avec des cellules knockdown YAP/TAZ avaient considérablement réduit la charge métastatique. L’analyse des poumons a montré que les cellules de renversement de YAP/TAZ ont formé beaucoup moins de métastases et que les métastases qui se sont formées étaient plus petites. Ces expériences démontrent comment les essais expérimentaux de métastes permettent à un chercheur de tester rapidement et à peu de frais le rôle d’un gène candidat dans la formation et la croissance de métastes. Ils montrent en outre comment l’utilisation combinée de l’imagerie animale vivante et de la quantification fluorescente des métastases dans des poumons entiers permet au chercheur de mieux comprendre les étapes de la colonisation métastatique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques de la méthode
Il est essentiel d’optimiser le nombre de cellules injectées (étape 3) pour une lignée cellulaire donnée et une souche de souris, car cela peut grandement influencer le nombre de métastases qui se forment et la durée de l’expérience. Si trop de cellules sont injectées ou si les métastases se développent trop longtemps, les métastases peuvent être difficiles à compter, ce qui rend les effets de la manipulation génétique difficiles à évaluer. Cependant, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Emily Norton d’avoir aidé à l’aide aux infections virales et à la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également Ryan Kanai pour son aide dans l’acquisition d’images des poumons et Kate E. Tubbesing pour l’aide à l’analyse de l’image des métastases vertes dans les poumons. Nous remercions le personnel des installations de recherche animale pour leur soutien et leur aide dans la préparation de cette vidéo. Ce travail a été soutenu par une subvention Susan G. Komen Catalyseur de carrière qui a été accordée à J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| 10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
| 2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
| BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
| BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
| Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
| CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
| Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
| FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
| GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
| Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
| HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
| Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
| Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
| Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
| Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
| Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
| Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
| Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
| Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
| Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
| Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
| SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
| TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
| TBST buffer | For western blot | ||
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
| Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
| VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
| Western transfer buffer | For western blot | ||
| XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
| YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |
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