De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.
Metastase is de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen en er zijn beperkte therapeutische opties voor patiënten met gemetastaseerde ziekte. De identificatie en het testen van nieuwe therapeutische doelstellingen die de ontwikkeling van betere behandelingen voor gemetastaseerde ziekten zullen vergemakkelijken, vereisen preklinische in vivo-modellen. Gedemonstreerd hier is een syngene muismodel voor borstkanker gemetastaseerde kolonisatie en daaropvolgende groei. Gemetastaseerde kankercellen worden stabiel met virale vectoren gecodeerd Firefly plaats en zsgreen eiwitten. Kandidaatgenen worden vervolgens stabiel gemanipuleerd in Luciferase/ZsGreen-uitdrukken van kankercellen en vervolgens worden de cellen via de laterale staart ader geïnjecteerd in muizen om gemetastaseerde kolonisatie en groei te assay. Een in vivo imaging-apparaat wordt vervolgens gebruikt om de Bioluminescentie of fluorescentie van de tumorcellen in de levende dieren te meten om veranderingen in de gemetastaseerde last na verloop van tijd te kwantificeren. De uitdrukking van het fluorescerende eiwit maakt het mogelijk het aantal en de grootte van metastasen in de longen aan het einde van het experiment te kwantificeren zonder dat er een snij-of histologische kleuring nodig is. Deze aanpak biedt een relatief snelle en eenvoudige manier om de rol van kandidaatgenen in gemetastaseerde kolonisatie en groei te testen, en biedt veel meer informatie dan de traditionele metastase-assays van de staart ader. Met deze aanpak tonen we aan dat gelijktijdige knock-down van Ja geassocieerde eiwitten (YAP) en transcriptionele co-Activator met een PDZ-bindend motief (TAZ) in borstkankercellen leidt tot een verminderde metastatische last in de longen en dat deze lagere last het resultaat is van een significant verminderde gemetastaseerde kolonisatie en verminderde groei van metastasen.
Kanker blijft de tweede leidende doodsoorzaak wereldwijd1 en metastase is verantwoordelijk voor de meerderheid van deze sterfgevallen2,3. Een beperkt begrip van de moleculaire mechanismen die de gemetastaseerde kolonisatie en de daaropvolgende groei beheersen, heeft echter de ontwikkeling van effectieve behandelingen voor gemetastaseerde ziekte belemmerd. De identificatie van nieuwe therapeutische doelstellingen vereist een assay om te testen hoe verontrust expressie of functie van een kandidaatgen invloed heeft op metastase vorming en groei. Hoewel autochtone Mouse-modellen hun voordelen hebben, zijn ze tijdrovend en duur om te genereren, waardoor ze geschikter zijn voor doel validatie in plaats van doel detectie. Transplantatie modelsystemen waarbij het aspirant-gen in kankercellen in vitro wordt verstoord en vervolgens effecten op gemetastaseerd potentieel worden beoordeeld in vivo, zijn minder duur en hoger doorvoer dan autochtone modellen. Bovendien zijn virale vectoren voor stabiele levering van RNAi, CRISPR/CAS9 en transgenen op grote schaal beschikbaar, waardoor het relatief gemakkelijk is om vrijwel elk gen of genen van belang in een kankercellijnen te perturb. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om de rol van kandidaatgenen bij gemetastaseerde kolonisatie en groei in menselijke kankercellijnen te testen door de cellen in immuungecompromitteerde of gehumaniseerde muizen te verplanten.
De twee soorten assays die worden gebruikt om metastase vorming te testen door getransplanteerde kankercellen in vivo zijn spontane metastase-assays en experimentele metastase-assays. In spontane metastase testen4,5, kankercellen worden geïnjecteerd in muizen, toegestaan om een primaire tumor te vormen, en vervolgens spontane metastasen vorming en daaropvolgende groei worden getest. De sterkte van dit model is dat de cellen alle stappen van het metastatische proces moeten voltooien om gemetastaseerde tumoren te vormen. Echter, veel kanker cellijnen niet metastaseren efficiënt in spontane metastase modellen, en elke manipulatie van de cellen die invloed hebben op primaire tumorgroei kan de resultaten van de metastase assay Verwar. Experimentele metastase-assays, waarin kankercellen direct in omloop worden geïnjecteerd, worden gebruikt om deze valkuilen te voorkomen. Gemeenschappelijke experimentele metastase-assays omvatten de staart ader injectie6,7,8 (en gedemonstreerd hier), intracardiale injectie9, en portaal ader injectie10.
Het doel van het hier gepresenteerde protocol is om een in vivo experimentele metastase test te bieden die een onderzoeker in staat stelt om metastase vorming en groei in real time te monitoren, alsook om het aantal en de grootte van het eindpunt in de longen van dezelfde muis te kwantificeren. Om dit te bereiken, wordt de traditionele experimentele staart ader metastase assays6,7,8 gecombineerd met levende dieren beeldvorming, met behulp van een in vivo beeldapparaat9,11,12,13,14. Tumor cellen met een stabiel uitdrukken van beide plaats en een fluorescerend eiwit worden geïnjecteerd in muizen via de laterale staart ader en vervolgens wordt het in vivo beeldapparaat gebruikt om veranderingen in de gemetastaseerde belasting in de longen na verloop van tijd te meten (Figuur 1). De in vivo levende dier beeldvormings inrichting kan echter de grootte van individuele metastasen niet onderscheiden of meten. Zo wordt aan het einde van het experiment een fluorescerende stereomicroscoop gebruikt om het aantal te tellen en de grootte van de fluorescerende metastasen in de longen te meten zonder de noodzaak voor snijden en histologie of immunohistochemie (Figuur 1). Dit protocol kan worden gebruikt om te testen hoe het veranderen van de uitdrukking of functie van een kandidaatgen invloed heeft op metastase vorming en groei. Potentiële therapeutische verbindingen zoals kleine moleculen of functie blokkerende antilichamen kunnen ook worden getest.
Om deze aanpak te demonstreren, hebben we eerst een proof of concept experiment uitgevoerd waarin de essentiële replicatiefactor, replicatie eiwit a3 (RPA3) is neergeslagen in gemetastaseerde muizen borstkankercellen. We laten zien dat muizen die geïnjecteerd zijn met RPA3 knockdown cellen significant minder gemetastaseerde last hebben op elk tijdstip in vergelijking met muizen die met controle cellen worden geïnjecteerd. Analyse van de metastasen-bevattende longen toont aan dat deze verlaagde gemetastaseerde belasting het resultaat is van significant gereduceerde gemetastaseerde kolonisatie en verminderde groei van de uitzaaiingen die vormen. Om deze techniek verder aan te tonen, hebben we getest of gelijktijdige knock-down van Ja-geassocieerde eiwitten (YAP) en transcriptionele co-Activator met een PDZ-bindend motief (TAZ) de metastatische kolonisatie of daaropvolgende groei belemmert. YAP en TAZ zijn twee gerelateerde transcriptionele co-Activators die de kritische stroomafwaartse Effectors van de Hippo pathway zijn. We15,16 en anderen hebben betrokken Yap en taz in metastasen (beoordeeld in17,18,19), wat suggereert dat deze eiwitten goede therapeutische doelen zijn. Consequent, ontdekten we dat muizen geïnjecteerd met YAP/TAZ knockdown cellen aanzienlijk verminderde gemetastaseerd Last. Analyse van de longen toonde aan dat de YAP/TAZ knockdown cellen veel minder metastasen vormden en dat de metastasen die vorm kregen kleiner waren. Deze experimenten laten zien hoe experimentele metastase testen een onderzoeker in staat stellen om snel en goedkoop de rol van een kandidaat-gen in metastase vorming en groei te onderzoeken. Ze laten verder zien hoe het gecombineerde gebruik van levende dierlijke beeldvorming en fluorescerende kwantificering van metastasen in hele longen de onderzoeker in staat stelt om de stappen tijdens gemetastaseerde kolonisatie beter te begrijpen.
Kritieke stappen van de methode
Het is van cruciaal belang om het aantal geïnjecteerde cellen te optimaliseren (stap 3) voor een bepaalde cellijn en muis stam, omdat dit het aantal metastasen dat vorm en de lengte van het experiment sterk kan beïnvloeden. Als te veel cellen worden geïnjecteerd of de metastasen te lang groeien, kunnen de metastasen moeilijk te tellen zijn, waardoor de effecten van de genetische manipulatie moeilijk te beoordelen zijn. Echter, als er te weinig cellen worden geïnject…
The authors have nothing to disclose.
We danken Emily Norton voor het bijstaan van virale infecties en het kritisch lezen van het manuscript. We bedanken Ryan Kanai ook voor hulp bij het verwerven van beelden van de longen en Kate E. Tubbesing voor hulp bij beeldanalyse van de groene metastasen in de longen. We danken het personeel van de dierenonderzoekfaciliteit voor hun ondersteuning en voor hulp bij de voorbereiding van deze video. Dit werk werd gesteund door een Susan G. komen Career Catalyst subsidie die werd toegekend aan J.M.L. (#CCR17477184).
10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
TBST buffer | For western blot | ||
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
Western transfer buffer | For western blot | ||
XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |