Крыса молочной эпителиальной трансплантации клеток в межлопатулярный белый жир Pad
Summary
Эта статья описывает метод трансплантации для того чтобы трансплантат аренить донора крысы эпителиальные клетки в interscapular белый тучная пусковая площадка животных реципиента. Этот метод может быть использован для изучения воздействия принимающей и/или донорской помощи на развитие эпителия молочной железы и устраняет необходимость предварительной очистки, тем самым расширяя полезность этого метода.
Abstract
Уже в 1970-х годах исследователи успешно пересадили эпителиальные клетки молочной железы в межскапулярную белую жировую подушечку крыс. Прививка эпителия с использованием методов трансплантации использует гормональную среду, предоставляемую хозяином грызунов-подростков. Эти исследования идеально подходят для изучения влияния различных биологических манипуляций на развитие молочной железы и вскрыть многие аспекты биологии молочной железы. Общей, но ограничивающей особенностью является то, что пересаженные эпителиальные клетки находятся под сильным влиянием окружающей стромы и перебора с эндогенным эпителием; для использования родной ткани молочной железы, брюшной-ингуинального белого жира площадку должны быть очищены, чтобы удалить хост эпителия молочной железы до трансплантации. Основным препятствием при использовании крысмодели организма является то, что очистка развивающихся молочных деревьев в пост-отлуженных крыс не является эффективным. При пересадке в железо-свободных жировых прокладок, донорэпилические клетки могут заселить очищенный хозяин жира площадку и образуют функциональную железу. Межлопатулярный жир площадку является альтернативным местом для этих трансплантатов. Основным преимуществом является то, что он не хватает протоковых структур еще обеспечивает нормальную стромы, что необходимо для содействия эпителиального роста и легко доступны в крысы. Еще одним важным преимуществом этого метода является то, что он является минимально инвазивным, потому что он устраняет необходимость приживать и удалить растущее эндогенное дерево молочной железы. Кроме того, межлопатулярный жир колодки содержит медиальный кровеносный сосуд, который может быть использован для отдельных сайтов для прививки. Поскольку эндогенные железы остаются нетронутыми, этот метод также может быть использован для исследований, сравнивая эндогенную маммарию железу с пересаженной железой. В этой статье описывается метод пересадки эпителиальной клетки молочной железы в межлопатулярную белую жировую подушечку крыс.
Introduction
Послеродовой развития молочной железы и трансконал морфогенеза процессы в значительной степени зависит от гормональной сигнализации в начале полового созревания. У мышей и крыс, широко используемых модельных организмов биологии молочной железы, этот процесс начинается около 3 недель возраста, где быстрое распространение и дифференциация приводят к образованию зрелой паренхимы. Зрелая железа может пройти многочисленные раунды расширения и инволюции, имущество, которое было под следствием с начала20-го века. В контексте гиперраспространения и развития рака, методы трансплантации молочной железы были разработаны в 1950-х годах1, и усиливается количественной методологии способствовали Гулд и др. в 1977году 2,3,4. Уточнение метода трансплантации у грызунов способствовало крупным достижениям в понимании нормальной биологии молочных желез, которые до сих пор широко используются для изучения влияния различных методов лечения и генетических манипуляций на нормальное развитие молочной железы и состояния болезней.
Многие гипотезы были созданы и впоследствии протестированы с помощью трансплантации молочной железы, впервые описанной DeOme et al. в 1959году 1. Эксперименты в течение нескольких десятилетий показали склонность протоковой ткани, вырезанной из донорских молочных желез, чтобы заселить весь жир площадку5,6,7 и указали, что важнейший компонент развития молочной железы находится в этих эпителиальных структур. Более поздние исследования на мышах показали, что одна клещевая клетка может заселить очищенную жировую подушечку и способствовала открытию одного, общего прародителя базальных и светящихся молочных эпителиальных клеток8,9,10. В соответствии с этими выводами, было высказано предположение, что трансплантация увеличивает пул клеток с многолинейным потенциалом перенаселения в результате пластичности, что позволяет привитых клеток расти функциональной молочной железы7,10,11,12,13. Важно отметить, что использование методов трансплантации у грызунов преодолевает ограничения клеточной культуры индуцированных аномалий14 и часто дает результаты всего за несколько недель.
Хотя процедура была первоначально описана в контексте предопластических поражений у мышей, вскоре она была расширена до крыс и используется в сочетании с канцерогеном лечения установить множественность как мера восприимчивости к раку15, но популярность методов трансплантации последовала развитие генетических инструментов для каждого вида. Хотя исследования мыши, включающие трансплантацию, способствовали многим трансляционным выводам, паренхима крысиной молочной железы напоминает человека более близко16,17 и предлагает четкие преимущества для изучения эстрогена рецептор-положительный (ЭРЗ) рак молочной железы. Опухоли молочной железы являются индуцируемыми у обоих видов, но они отличаются с точки зрения чувствительности гормонов и профилей экспрессии генов. Основное отличие заключается в том, что крысиные опухоли молочной железы выражают и зависят от функции рецепторов гормона яичника и гипофиза, а именно эстрогена и прогестерона (PR), подобно подтипу светящегося а рака молочной железы человека. Действительно, трансплантация эпителиальной клетки молочной железы, как описано в этом протоколе, была использована для изучения генетических вариантов, участвующих в раке молочной железы и определить клеточную автономию воздействия на эпителиальные клетки молочной железы18.
В дополнение к биологии опухоли, протоковой эпителий нормальной крысиной молочной железы экспонатов более высокий уровень ветвления и в окружении толще слой стромы, чем мышь. Важность стромы хорошо документирована в исследованиях эпителиальной трансплантации молочной железы. Маммарийский эпителий должен взаимодействовать с жировой стромы, а в идеале и собственным мезенхимом, чтобы пройти свой характерный морфогенез19,20. Прививка ткани в реципиентную маммарийскую железу обеспечивает оптимальную среду; однако наличие эндогенного эпителия может повлиять на результаты. Предварительная очистка молочной железы эндогенного эпителия обычно выполняется в анализе трансплантации мыши и требует хирургического иссечения эндогенной ткани молочной железы и/или удаления соска1,21,22. Хотя это возможно, preclearing эпителия молочной железы в после отлохоты крыс не так широко выполняется, в основном из-за неэффективности очистки растущего молочного дерева в после отлохоты крыс. Так как было показано, что регионы жировой ткани в других частях тела может поддерживать рост пересаженного эпителия молочной железы21,23,24, процесс предварительного очищения можно легко избежать у крыс путем прививки ткани в interscapular белый жир площадку.
Метод трансплантации, описанный в настоящей работе, включает в себя инъекцию ферментативно диссоциированных органоидов молочных желез (фрагменты молочного протокового эпителия и других типов клеток, способных к морфогенезу) или монодисперсированных клеток в межпросветительную жировую площадку в инбредных, изогенных или конгенических штаммах лабораторных крыс2. Поскольку межсезонная жировая подушечка, как правило, лишена молочной ткани, она обеспечивает подходящую среду для нескольких мест трансплантации без необходимости предварительного очищенного эндогенного эпителия. В результате эндогенные, брюшно-ингиналовые молочные железы животного не подвергаются хирургическим манипуляциям, развиваются нормально и не могут вмешиваться в интерпретацию результатов. Кроме того, нетронутые молочные железы могут быть использованы для сравнения для оценки принимающей против донорского воздействия на развитие эпителия молочной железы и опухоли18,25. Хотя перенаселение молочной железы из одной стволовой клетки доступна для мышей, она еще не была разработана для крыс, в основном из-за отсутствия антител, чтобы выбрать для крыс ы молочных стволовых клеток25,26,27. Несмотря на это, трансплантация монодисперсных эпителиальных клеток молочной железы для количественной оценки потенциала перенаселенности может быть успешно выполнена, и эти клетки будут развиваться нормально, когда привиты в соответствующие рамки2,3,4. В то время как органоиды хороши для многих целей, монодисперсные клетки необходимы для количественного применения, например, для определения количества эпителиальных клеток молочной железы, необходимых для инициирования рака после ионизирующей лучевой терапии28 или для сравнения характеристик потока цитометрически выбранных популяций эпителиальных клеток29.
На сегодняшний день описанная здесь процедура является наиболее надежным методом проведения трансплантации молочной железы у крысы с общей целью изучения развития молочной железы и механизмов, лежащих в основе развития рака молочной железы. Часто доноры и/или животные-реципиенты подвергаются воздействию различных переменных до, во время или после эпителиальной трансплантации. Примеры включают в себя один ген исследования с участием химического канцерогенеза30, излучение28,31,32, генетические манипуляции хозяина / донора генома18, и гормональные манипуляции12. Основным преимуществом ферментативной диссоциации, описанной в этом протоколе, является возможность изолировать эпителиальные органоиды или монодисперсные клетки для дополнительных экспериментов с участием цитометрии потока, трехмерной культуры, редактирования генов и многое другое. Будущие применения этого метода будут включать дополнительные манипуляции донорской и/или принимающей ткани с помощью генной инженерии. Например, донорские клетки могут быть генетически изменены ex vivo в любом выбранном геномном локусе с помощью системы редактирования генов CRISPR-Cas9. Аналогичным образом, крысы-реципиенты также могут быть генетически изменены для изучения взаимодействия между донором и реципиентом инженерных генетических факторов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод трансплантации эпителиальной клетки молочной железы, оптимизированный для работы с крысами. Изолированные эпителиевые органоиды молочной железы от крыс-доноров (3-5 недель) прививаются в межлопатулярный белый жир площадку крыс-реципиента (также 3-5 недель …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована Холлингс онкологический центр онкологический центр поддержки Грант P30 CA138313 экспериментального финансирования исследований от Национальных институтов здравоохранения(https://www.nih.gov/), и средства от Департамента патологии и лабораторной медицины в Медицинском университете южной Каролины. Мы хотели бы поблагодарить Марийн Смитс за запись интервью заявления.
Materials
| 0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
| 1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
| 100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
| 100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
| 1000 uL pipette tips + pipette | – | – | transferring cells/mixtures/tissue |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
| 40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
| 50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
| 60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
| Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
| Anesthesia vaporizer for veterinary use | – | – | follow institutional protocol |
| Beta-dine or iodine | – | – | |
| Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
| Cell counting apparatus | – | – | |
| Clean animal cages for recovery | – | – | follow institutional protocol |
| Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
| deionized water | – | – | for chemical solutions |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
| EDTA | – | – | monodispersion mixture |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | – | inactivation solution |
| Gauze | – | – | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
| HBSS | GIBCO | – | monodispersion mixture |
| Heating pads | – | – | follow institutional protocol |
| Ice buckets (x2) | – | – | |
| Incubator with orbital rotation | – | – | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
| Isoflurane anesthesia | – | – | follow institutional protocol |
| Light microscope or digital camera | – | – | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
| Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | – | TissueMiser or alternative models |
| Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
| Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | – | – | follow institutional protocol |
| Paper towels or delicate task wipes | – | – | |
| Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
| Postoperative analgesic | – | – | Institutional protocol |
| Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
| Shaver | – | – | electric clippers, or other |
| Staining jars | – | – | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
| Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
| Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | – | – | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
| Syringes: 5 mL (or greater) | – | – | for sterile filtration of collagenase digestion media |
| Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
| Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | – | – | |
| Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |
References
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
- Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H. Morphological and quantitative studies of gland formation from inocula of monodispersed rat mammary cells. Experimental Cell Research. 107 (2), 405-416 (1977).
- Gould, M. N., Clifton, K. H. The Survival of Mammary Cells Following Irradiation in Vivo A Directly Generated SingleDose-Survival Curve. Radiation Research. 72 (2), 343 (1977).
- Gould, M. N., Clifton, K. H. The survival of rat mammary gland cells following irradiation in vivo under different endocrinological conditions. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 4 (7-8), 629-632 (1978).
- Hoshino, K., Gardner, W. U. Transplantability and Life Span of Mammary Gland during Serial Transplantation in Mice. Nature. 213 (5072), 193-194 (1967).
- Ormerod, E. J., Rudland, P. S. Regeneration of mammary glands in vivo from isolated mammary ducts. Development. (96), 229-243 (1986).
- Smith, G. H., Medina, D. A morphologically distinct candidate for an epithelial stem cell in mouse mammary gland. Journal of Cell Science. 90 (1), 173 (1988).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Sleeman, K. E., Kendrick, H., Ashworth, A., Isacke, C. M., Smalley, M. J. CD24 staining of mouse mammary gland cells defines luminal epithelial, myoepithelial/basal and non-epithelial cells. Breast Cancer Research. 8 (1), R7 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Kamiya, K., Gould, M. N., Clifton, K. H. Quantitative studies of ductal versus alveolar differentiation from rat mammary clonogens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 219 (3), 217-225 (1998).
- Kim, N. D., Oberley, T. D., Yasukawa-Barnes, J., Clifton, K. H. Stem cell characteristics of transplanted rat mammary clonogens. Experimental Cell Research. 260 (1), 146-159 (2000).
- Daniel, C. W. Growth of Mouse Mammary Glands in vivo after Monolayer Culture. Science. 149 (3684), 634 (1965).
- Beuving, L. J., Faulkin, L. J., DeOme, K. B., Bergs, V. V. Hyperplastic Lesions in the Mammary Glands of Sprague-Dawley Rats After 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene Treatment. Journal of the National Cancer Institute. 39 (3), 423-429 (1967).
- Russo, J., Rubin, E., Damjanov, I., et al. Comparative Study of Human and Rat Mammary Tumorigenesis. Pathology Reviews. , 217-251 (1990).
- Nandi, S., Guzman, R. C., Yang, J. Hormones and mammary carcinogenesis in mice, rats, and humans: a unifying hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (9), 3650-3657 (1995).
- Ding, L., et al. Deletion of Cdkn1b in ACI rats leads to increased proliferation and pregnancy-associated changes in the mammary gland due to perturbed systemic endocrine environment. PLoS Genetics. 15 (3), e1008002 (2019).
- Sakakura, T., Nishizuka, Y., Dawe, C. Mesenchyme-dependent morphogenesis and epithelium-specific cytodifferentiation in mouse mammary gland. Science. 194 (4272), 1439-1441 (1976).
- Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Dual origin of mesenchymal tissues participating in mouse mammary gland embryogenesis. Developmental Biology. 91 (1), 202-207 (1982).
- Faulkin, L. J., Deome, K. B. Regulation of Growth and Spacing of Gland Elements in the Mammary Fat Pad of the C3H Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 24, 953-969 (1960).
- Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis. Laboratory Animals. 42 (1), 104-110 (2008).
- Hoshino, K. Morphogenesis and growth potentiality of mammary glands in mice. I. Transplantability and growth potentiality of mammary tissue of virgin mice. Journal of the National Cancer Institute. 29, 835-851 (1962).
- Hoshino, K. Regeneration and growth of quantitatively transplanted mammary glands of normal female mice. The Anatomical Record. 150 (3), 221-235 (1964).
- Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLOS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
- Kim, N. D., Clifton, K. H. Characterization of rat mammary epithelial cell subpopulations by peanut lectin and anti-Thy-1.1 antibody and study of flow-sorted cells in vivo. Experimental Cell Research. 207 (1), 74-85 (1993).
- Kim, N. D., Oberley, T. D., Clifton, K. H. Primary culture of flow cytometry-sorted rat mammary epithelial cell (RMEC) subpopulations in a reconstituted basement membrane, Matrigel. Experimental Cell Research. 209 (1), 6-20 (1993).
- Clifton, K. H., Tanner, M. A., Gould, M. N. Assessment of radiogenic cancer initiation frequency per clonogenic rat mammary cell in vivo. Cancer Research. 46 (5), 2390-2395 (1986).
- Sharma, D., et al. Quantification of epithelial cell differentiation in mammary glands and carcinomas from DMBA- and MNU-exposed rats. PLoS One. 6 (10), e26145-e26145 (2011).
- Smits, B. M. G., et al. The non-protein coding breast cancer susceptibility locus Mcs5a acts in a non-mammary cell-autonomous fashion through the immune system and modulates T-cell homeostasis and functions. Breast Cancer Research. 13 (4), R81-R81 (2011).
- Gould, M. N., Clifton, K. H. Evidence for a Unique in Situ Component of the Repair of Radiation Damage. Radiation Research. 77 (1), 149-155 (1979).
- Kamiya, K., Clifton, K. H., Gould, M. N., Yokoro, K. Control of ductal vs. alveolar differentiation of mammary clonogens and susceptibility to radiation-induced mammary cancer. Journal of Radiation Research. 32 (Suppl 2), 181-194 (1991).
- Sharma, D., et al. Effective flow cytometric phenotyping of cells using minimal amounts of antibody. BioTechniques. 53 (1), 57-60 (2012).
- Hewitt, H. B., Blake, E., Proter, E. H. The Effect of Lethally Irradiated Cells on the Transplantability of Murine Tumours. British Journal of Cancer. 28 (2), 123-135 (1973).
- Peters, L. J., Hewitt, H. B. The Influence of Fibrin Formation on the Transplantability of Murine Tumour Cells: Implications for the Mechanism of the Révész Effect. British Journal of Cancer. 29 (4), 279-291 (1974).
- Zhang, R., Haag, D., Gould, M. N. Quantitating the frequency of initiation and cH-ras mutation in in situ N-methyl-N-nitrosourea-exposed rat mammary gland. Cell Growth & Differentiation. 2 (1), 1-6 (1991).
- Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot origin affects adipogenesis in primary cultured and cloned human preadipocytes. American Journal of Physiology – Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 282 (5), R1286-R1296 (2002).
- Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
- Sanchez-Gurmaches, J., et al. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metabolism. 16 (3), 348-362 (2012).
- Hoshino, K. Transplantability of mammary gland in brown fat pads of mice. Nature. 213 (5072), 194-195 (1967).
- Sakakura, T., Sakagami, Y., Nishizuka, Y. Persistence of responsiveness of adult mouse mammary gland to induction by embryonic mesenchyme. Developmental Biology. 72 (2), 201-210 (1979).
- Alston-Mills, B., Rivera, E. M. Factors influencing differential growth of rat mammary tumor fragments and cells transplanted in gland-free and gland-containing mammary fat pads. European Journal of Cancer and Clinical Oncology. 21 (10), 1233-1243 (1985).
- Neville, M. C., Medina, D., Monks, J., Hovey, R. C. The mammary fat pad. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (2), 109-116 (1998).
- Smits, B. M. G., et al. The Gene Desert Mammary Carcinoma Susceptibility Locus Mcs1a Regulates Nr2f1 Modifying Mammary Epithelial Cell Differentiation and Proliferation. PLoS Genetics. 9 (6), e1003549 (2013).
