מאמר זה מתאר שיטת השתלת להשתיל השתל בפטמות האפיתל התאים לתוך משטח שומן לבן של בעלי חיים הנמען. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון את השפעות המארחים ו/או התורמים בהתפתחות האפיתל של הפטמות ומבטלת את הצורך בניקוי מראש, ובכך מרחיב את התועלת שבטכניקה זו.
מוקדם כמו שנות ה-70, החוקרים הושתל בהצלחה תאים אפיתל החלב לתוך משטח שומן לבנים לבן של חולדות. השתלת אפיתל החלב באמצעות טכניקות השתלת מנצל את הסביבה ההורמונלית המסופקים על ידי מארח מכרסם המתבגר. מחקרים אלה מתאימים באופן אידיאלי כדי לחקור את ההשפעה של מניפולציות ביולוגיות שונות על פיתוח בלוטת החלב ולנתח היבטים רבים של בלוטת החלב ביולוגית. נפוץ, אבל מגביל, תכונה היא כי התאים האפיתל המושתלים מושפעים מאוד על ידי משתית מסביב והתחרו על ידי אפיתל אנדוגניים; כדי לנצל את רקמת הפטמות הילידים, pad שומן לבן בבטן העור חייב להיות מנוקה כדי להסיר אפיתל הפטמות מארח לפני ההשתלה. מכשול גדול בעת שימוש באורגניזם מודל החולדה הוא שניקוי עץ הפטמות המתפתח בחולדות שלאחר-מכן אינו יעיל. כאשר מושתלים לתוך רפידות שומן ללא בלוטת, התאים האפיתל התורם יכול לאכלס משטח מארח נקי שומן ליצור בלוטת החלב תפקודית. משטח השומן הרפית הוא מיקום חלופי עבור השתלים אלה. היתרון העיקרי הוא שהוא חסר מבני ductal עדיין מספק את משתית נורמלי כי יש צורך לקדם את הצמיחה אפיתל והוא נגיש בקלות בחולדה. יתרון מרכזי נוסף של הטכניקה היא כי הוא פולשני מינימלית, כי זה מבטל את הצורך לצרוב ולהסיר את עץ הפטמות האנדוגניים גדל. בנוסף, פד שומן מכיל כלי דם המדיאלי שניתן להשתמש בו כדי להפריד אתרים להשתלת. בגלל בלוטות אנדודוגני להישאר שלם, טכניקה זו יכולה לשמש גם למחקרים השוואת בלוטת החלב אנדוגניים לבלוטה המושתלים. נייר זה מתאר את השיטה של השתלת תא האפיתל הפטמות לתוך משטח שומן לבן השכמה של חולדות.
התפתחות בלוטת החלב פוסט לידה ו ductal מורגנזה הם תהליכים המושפעים במידה רבה על ידי איתות הורמונלי בתחילת ההתבגרות. בעכברים וחולדות, בשימוש נפוץ במודלים של ביולוגיה של בלוטת החלב, תהליך זה מתחיל בסביבות 3 שבועות של גיל, שבו התפשטות מהירה ובידול התוצאה היווצרות של המבנה הבוגר. בלוטת החלב הבוגרת יכולה לעבור סבבים רבים של התרחבות ואינוולוציה, נכס שנחקר מאז תחילת המאהה -20. במסגרת ההקשר של היפרהפצה והתפתחות הסרטן, פותחו טכניקות השתלת בלוטת החלב בשנות ה-50 שלהמאה העשרים,והופרו על ידי המתודולוגיה הכמותית שתרמה גולד ואח ‘. ב-19772,3,4. עידון של טכניקת ההשתלה אצל מכרסמים תרם להתקדמות מרכזית בהבנת ביולוגיה רגילה של בלוטת החלב, כי הם עדיין בשימוש נרחב כדי ללמוד את ההשפעה של טיפולים שונים מניפולציה גנטית על פיתוח בלוטת החלב רגילה ומצבי מחלה.
השערות רבות נוצרו ונבדק לאחר מכן באמצעות השתלת בלוטת החלב, שתוארה לראשונה על ידי DeOme et al. ב 19591. ניסויים בכמה עשורים הראו את הנטייה של רקמת דוטל שנתרמה מבלוטות החלב של התורמים כדי לאכלס מראש את כל משטח השומן5,6,7 והצביע על כך שרכיב קריטי בהתפתחות בלוטת החלב שוכן במבני אפיתל אלה. מחקרים מאוחרים יותר בעכברים הראו כי תא גזע בודד יכול לאכלס משטח שומן נקי ותרם לגילוי של מעשה יחיד, משותף של התאים האפיתל הבליים והלומיאל של חלבשמונה,9,10. בשורה עם מסקנות אלה, הוצע כי ההשתלה מגדילה את בריכת התאים עם ריבוי היוחסין-מאכלס מחדש את הפוטנציאל כתוצאה של פלסטיות, ומאפשר לתאים המושתלים לצמוח בלוטת חלב תפקודית7,10,11,12,13. חשוב מכך, השימוש בטכניקות השתלת מכרסמים מתגבר על מגבלות של תאים המושרה התרבות התאי14 ולעתים קרובות מספק תוצאות רק עניין של שבועות.
בעוד ההליך תוארה במקור בהקשר של נגעים preneoplastic בעכברים, זה היה מורחב במהרה חולדות משמש בשילוב עם הטיפול מסרטן כדי להקים ריבוי כמדד של הרגישות לסרטן15, אבל הפופולריות של טכניקות השתלת עקב התפתחות של כלים גנטיים עבור כל מין. למרות לימודי העכבר המשלבים השתלת תרמו ממצאים טרנסלבותית רבים, המקרוב של בלוטת הפטמות של החולדה דומה לאדם הדוק יותר16,17 ומציע יתרונות ברורים ללמוד קולטן אסטרוגן-חיובית (ER +) סרטן השד. גידולי הפטמות מinducible בשני המינים, אך הם נבדלים במונחים של רגישות הורמונלית ופרופילי ביטוי גנטי. ההבדל העיקרי הוא כי גידולי הפטמות העכברים לבטא ותלוי בתפקוד של קולטני הורמונים השחלות ובלוטת יותרת השכל, כלומר, אסטרוגן ופרוגסטרון (PR), בדומה ללומיאל-סוג של סרטן השד האנושי. אכן, השתלת תא האפיתל הפטמות, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, נעשה שימוש כדי ללמוד משתנים גנטיים המעורבים בסרטן השד ולקבוע את האוטונומיה התאית של ההשפעות על תאים אפיתל הפטמות18.
בנוסף לביולוגיה של הגידול, האפיתל הדוטל של בלוטת הפטמות הרגילה מציגה רמה גבוהה יותר של הסתעפות ומוקף בשכבה עבה יותר של משתית מאשר העכבר. חשיבותו של הסטרומה מתועדת היטב במחקרים של השתלות האפיתל. אפיתל הפטמות חייב לקיים אינטראקציה עם משתית שומן, ובאופן אידיאלי משלה mesenchyme, כדי לעבור את המאפיין שלה מורפולגנזה19,20. השתלת רקמה בבלוטת החלב של המטופל מספקת סביבה אופטימלית; עם זאת, הנוכחות של אפיתל אנדוגני יכול להפריע לתוצאות. ניקוי בלוטת החלב של אפיתל אנדודוגני מבוצע בדרך כלל באמצעות השתלת העכבר בחני ודורש כריתה כירורגית של רקמת חלב אנדוגניים ו/או הסרת הפטמה1,21,22. למרות האפשר, מראש לנקות את האפיתל הפטמות בחולדות פוסט-weanling אינו מבוצע באופן נרחב, בעיקר בשל חוסר היעילות של ניקוי עץ הפטמות הגוברת בחולדות פוסט-weanling. מאז הוכח כי אזורים של רקמת האדיפוז במקום אחר בגוף יכול לתמוך בצמיחה של אפיתל החלב המושתלת21,23,24, תהליך של מראש ניתן להימנע בקלות חולדות על ידי השתלת רקמות לתוך pad שומן לבן הגלימה.
שיטת ההשתלה המתוארת במאמר זה כרוכה בהזרקה של אורגנואידים בלוטת החלב אנזיטיתיים (שברי האפיתל של הפטמות וסוגי תאים אחרים המסוגלים להיות מורפולגנזה) או תאים חד מפוצלים לתוך משטח השומן הבין-משני ב מונוגניים, או זנים של עכברי מעבדה2. בגלל pad שומן החוצה הוא נטול בדרך כלל של רקמת הפטמות, הוא מספק סביבה מתאימה עבור אתרי השתלת מרובים ללא צורך ברור מראש אפיתל אנדוגניים. כתוצאה מכך, האנדוגניים בעלי החיים המארחים, בלוטות החלב מבולי הבטן אינם כפופים לטיפול כירורגי, מפתחים כרגיל, ואינם יכולים להפריע לפרשנות של תוצאות. בנוסף, ניתן להשתמש בבלוטות החלב ללא שינוי לצורך השוואת המחשב המארח לעומת השפעות התורמים בהתפתחות האפיתל של החלב ובטומוריגנזה18,25. למרות שאכלוס מחדש של בלוטת החלב מתא גזע אחד זמין עבור עכברים, זה עדיין לא פותחה עבור עכברוש, בעיקר בשל חוסר הזמינות של נוגדנים לבחור עבור העכבר הפטמות גזע בתאי25,26,27. למרות זאת, השתלת תאים אפיתל מונוציתיים לכמת מחדש את הפוטנציאל ניתן לבצע בהצלחה, ותאים אלה יפתחו בדרך כלל כאשר מושתל במסגרת המתאימה2,3,4. בעוד אורגנואידים הם טובים עבור מטרות רבות, תאים חד מפוזרים נדרשים עבור יישומים כמותיים, למשל, כדי לקבוע את מספר התאים האפיתל החלב הנדרש עבור החניכה סרטן בעקבות טיפול קרינה מייננת28 או להשוואת מאפייני הזרימה הצילתית של הפטמות של תאים האפיתל שנבחרו בשנת29.
עד היום, ההליך המתואר כאן הוא השיטה החזקה ביותר של ביצוע השתלת בלוטת החלב בחולדה עם מטרה כוללת של לימוד פיתוח בלוטת החלב ומנגנונים בבסיס התפתחות סרטן השד. לעתים קרובות, התורם ו/או בעלי החיים נחשפים למשתנים שונים לפני, במהלך, או אחרי השתלת האפיתל. דוגמאות כוללות לימודי גנים בודדים מעורבים כימיים קרצינובגנזה30, קרינה28,31,32, מניפולציה גנטית של מארח/הגנום תורם18, ו מניפולציה הורמונליים12. היתרון העיקרי של הדיסוציאציה האנזימטית המתואר בפרוטוקול זה הוא ההזדמנות לבודד תאי אפיתל או תאים חד מבודדים עבור ניסויים משלימים הכרוכים בזרימה, תרבות תלת-ממדית, עריכת גנים ועוד. יישומים עתידיים של טכניקה זו יכלול מניפולציה נוספת של התורם ו/או מארח רקמות עם הנדסה גנטית. לדוגמה, תאים תורמים יכולים להיות מהונדסים גנטית לשעבר vivo בכל מקום גנומית שנבחרה באמצעות CRISPR-Cas9 המערכת לעריכת גנים. באופן דומה, חולדות הנמען יכול גם להיות שונה גנטית כדי ללמוד את האינטראקציה בין התורם לבין המטופל הנדסה גורמים גנטיים.
פרוטוקול זה מתאר טכניקת השתלת תאים אפיתל הפטמות האופטימיזציה לעבודה עם חולדות. מבודדים האפיתל הפטמות מבונואידים של חולדות תורם (3-5 שבועות של גיל) הם מושתלים לתוך משטח שומן לבן השכמה של חולדות הנמען (גם 3-5 שבועות של גיל). ניתן לפרש את התוצאות במעט כמו 4-6 שבועות מאוחר יותר, תוך שימוש במיקרוסקופ…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומן על ידי המרכז לסרטן הולנגס של סרטן המרכז תמיכה גרנט P30 CA138313 מחקר הטייס מימון המכון הלאומי לבריאות (https://www.nih.gov/), וכספים מן המחלקה לפתולוגיה &Amp; מעבדה רפואה באוניברסיטת הרפואה של דרום קרוליינה. היינו רוצים להודות למרינה סמית. על שהקליט את הצהרות הראיון
0.2 µM syringe filters | Fisher Scientific | 09-715G | sterile-filtering collagenase digestion media |
1.5 – 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 05-408-129 | containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture |
100 µM cell strainers | Corning | 431752 | filtering brain homogenate |
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles | Hamilton | 81001 & 90525 | For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition) |
1000 uL pipette tips + pipette | – | – | transferring cells/mixtures/tissue |
15 mL polypropylene tube | Falcon (Corning) | 352196 | brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation |
40 µM cell strainers | Corning | 431750 | filtering organoids after washing the cell pellet |
50 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | for collagenase digestion of donor mammary gland tissue |
60 mm dishes | Thermo Scientific | 130181 | for mincing tissue |
Alum Potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | staining mammary gland whole mount slides |
Anesthesia vaporizer for veterinary use | – | – | follow institutional protocol |
Beta-dine or iodine | – | – | |
Borosilicate glass culture tube for homogenization | Fisher Scientific | 14-961-26 | for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer) |
Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | staining mammary gland whole mount slides |
Cell counting apparatus | – | – | |
Clean animal cages for recovery | – | – | follow institutional protocol |
Collagenase Type 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats |
deionized water | – | – | for chemical solutions |
DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures |
EDTA | – | – | monodispersion mixture |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted) |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | – | inactivation solution |
Gauze | – | – | |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol) |
HBSS | GIBCO | – | monodispersion mixture |
Heating pads | – | – | follow institutional protocol |
Ice buckets (x2) | – | – | |
Incubator with orbital rotation | – | – | must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue) |
Isoflurane anesthesia | – | – | follow institutional protocol |
Light microscope or digital camera | – | – | visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images |
Mechanical homogenizer | Fisher Scientific | – | TissueMiser or alternative models |
Mineral oil, pure | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | long-term storage of cleared mammary gland whole mounts |
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer | – | – | follow institutional protocol |
Paper towels or delicate task wipes | – | – | |
Positively-charged microscope slides | Thermo Scientific | P4981-001 | mammary gland tissue whole mounts |
Postoperative analgesic | – | – | Institutional protocol |
Scale | body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication | ||
Shaver | – | – | electric clippers, or other |
Staining jars | – | – | minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred |
Sterile field drapes | IMCO | 4410-IMC | used during transplantation |
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) | – | – | autoclave surgical tools used for donors and recipients |
Syringes: 5 mL (or greater) | – | – | for sterile filtration of collagenase digestion media |
Trypsin | Worthington | monodispersion mixture | |
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) | – | – | |
Wound clip applier, clips, and removal tool | Fine Science Tools | 12020-00 | Closing the skin incision over the interscapular white pad pad |
Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | clearing mammary gland whole mount slides after staining |