Summary

天然ポリフェノールクルクミンを用いた脳組織におけるアミロイドプラークの標識とイメージング

Published: November 01, 2019
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Summary

クルクミンは、アミロイドベータタンパク質への優先結合、ならびに他の伝統的なアミロイド結合色素との構造的類似性に起因する脳組織におけるアミロイドベータタンパク質プラークの標識およびイメージングのための理想的な蛍光色素である。これは、従来の方法よりも効率的かつ安価にアミロイドベータタンパク質プラークをラベル付けし、画像化するために使用することができます。

Abstract

細胞外および細胞内空間におけるアミロイドβタンパク質(Aβ)の沈着は、アルツハイマー病(AD)の顕著な病理の一つである。したがって、AD脳組織におけるAβの存在の検出は、ADの進行を防止するための新しい治療法を開発するための貴重なツールである。いくつかの古典的なアミロイド結合色素、フルオロクロム、イメージングプローブ、およびAβ特異的抗体がAD脳組織においてAβ組織化学的に検出するために使用されている。Aβ検出のためのこれらの化合物の使用は、コストと時間がかかります。しかし、その強烈な蛍光活性、高親和性、およびAβの特異性、ならびに従来のアミロイド結合色素との構造的類似性のために、クルクミン(Cur)は死後のAβプラークの標識およびイメージングのための有望な候補である脳組織。ハーブクルクマロンガから天然ポリフェノールです。本研究では、Curは、5x家族性アルツハイマー病(5xFAD)の遺伝的マウスモデルと1分以内にヒトAD組織の両方からAβプラークを組織化学的に標識するために使用された。Curの標識能力は、チオフラビン-S(チオ-S)、コンゴレッド(CR)、フルオロジェイドC(FJC)、ならびにAβ特異的抗体(6E10およびA11)などの従来のアミロイド結合色素と比較した。Curは、これらの従来の染料と比較して、Aβプラークを標識および画像化する最も安価で迅速な方法であり、Aβ特異的抗体に匹敵することを観察しました。さらに、CurはオリゴマーやフィブリルなどのほとんどのAβ種と結合する。したがって、Curは、Aβプラークの最も費用対効果が高く、シンプルで迅速なフルオロクロム検出剤として使用することができる。

Introduction

アルツハイマー病(AD)は、最も一般的な、年齢関連、進行性神経疾患の一つであり、世界的に死亡の主要な原因の一つである1、2。学習、記憶、認知障害は、神経精神障害と共に、AD3に現れる一般的な症状である。ADの病因は完全には解明されていないが、利用可能な遺伝的、生化学的、および実験的証拠は、Aβの段階的な沈着がAD4の決定的なバイオマーカーであることを示す。この誤った折り畳まれたタンパク質は、細胞内および細胞外空間に蓄積し、AD5の影響を受ける脳の皮質および海馬領域におけるシナプス損失、神経炎症の増加、および神経変性に関与すると考えられている。したがって、AD組織におけるAβの組織化学的検出は、ADの進行を防ぐために非毒性、抗アミロイド薬を開発する上で重要な第一歩である。

過去数十年の間に、いくつかの染料および抗体は、脳組織のAβプラークを標識および画像化するために多くの研究所で使用されてきましたが、これらの方法のいくつかは時間がかかり、使用される染料や抗体は高価であり、いくつかの付属品を必要とします化学 物質。したがって、AD脳におけるAβプラークの検出の安価な手段の開発は、歓迎される新しいツールであろう。多くの研究室は、Aβの標識およびイメージングのための有望な抗アミロイド天然ポリフェノールであるCur、ならびにAD6、7、8、9の治療薬を使用し始めました。その疎水性と好中性、古典的なアミロイド結合色素との構造的な類似性、強い蛍光活性、ならびにAβと結合する強い親和性は、AD組織10におけるAβプラークの標識およびイメージングのための理想的な蛍光色素を作る.CurはAβプラークおよびオリゴマーと結合し、その存在はまた、細胞内空間7、11、12、13においても検出される。さらに、Curの最小量(1−10nM)は、5x家族性アルツハイマー病(5xFAD)脳組織7においてAβプラークを標識できることが示されている。1nM濃度はAβプラークの計数に最適な蛍光強度を提供しないが、Curの10nM以上の濃度を有する。ランと同僚14は、ジフルオロボロン誘導体化Curの0.2 nMの低用量が、赤外線プローブとほぼ同様に生体内のAβ沈着物を検出できることを報告した。この用量が組織中のAβプラークを標識するのに十分であるかどうかはまだ明らかではない。これまでの研究のほとんどは、Curを使用してAβプラークを染色するために20−30分を使用していますが、最適な染色は、はるかに少ない時間を必要とするかもしれません。

本研究は、CURがAD脳組織のAβプラークにラベルを付け、他の従来のCurで染色した後の5xFADマウスからの脳組織におけるAβプラークの標識およびイメージングに対する感受性を比較するために必要な最小時間をテストすることを目的とした。チオフラビン-S(チオ-S)、コンゴ赤(CR)、フルオロジェイドC(FJC)などのAβ結合性染料。これらの古典的なアミロイド結合色素のAβ標識能力は、5xFADマウスおよび老化一致したヒトADおよび制御脳組織からのパラフィン埋め込みおよび凍結石コロナ脳切片における硬化染色と比較された。この知見は、CurがAβ特異的抗体(6E10)と同様の方法でAβプラークを標識し、チオS、CR、またはFJCよりも適度に優れていることを示唆している。また、5xFADマウスに対する心腹腔内注射を2〜5日間投与した場合、血液脳関門を通過し、Aβプラーク7と結合した。興味深いことに、Curのナノモル濃度は、5xFAD脳組織7、14におけるAβプラークの標識および画像使用されている。さらに、形態学的に異なるAβプラークは、コア、神経学的、拡散、および焼失したプラークを、他の従来のアミロイド結合色素7のいずれよりも効率的にCurによって標識することができる。全体的に、Curは、Aβ特異的抗体に対する信頼性の高い代替として、AD動物モデルおよび/またはヒトAD組織からの死後脳組織における標識および画像Aβプラークに容易かつ安価な方法で適用することができる。

Protocol

ここで説明するすべての方法は、サギノーバレー州立大学の動物ケアと使用委員会(ACUC)によって承認されています.ヒト組織は、アリゾナ州のバナーサンヘルス研究所で確立された脳バンクから得られた15,16. 1. 動物の灌流 固定バッファーと灌流バッファーを準備します。 0.1 M 塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム2g(…

Representative Results

クルクミンは1分以内にAβプラークをラベル付けします。5xFAD組織をCurで染色したところ、1分以内にCur標識Aβプラークが見つかった。Curによるインキュベーション時間の増加はAβプラークの蛍光強度をわずかに増加させるが、観察されたAβプラークの数は1分と5分の染色時間の間で有意に異なっていなかった(図1)。 <p class="jove_content" fo:keep-togeth…

Discussion

私たちの仮説は、Curが他の古典的なアミロイド結合色素と比較して、死後AD脳組織におけるAβプラークを標識し、画像化する最も速く、最も簡単で、最も安価な方法として使用することができ、Aβ特異的抗体と比較して行うことができた。本研究の目的は、死後AD脳組織におけるCurによるAβプラークの標識および画像化に要する最小時間を決定し、CurがAβプラークを標識するためのAβ抗体の代…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究のサポートは、セントメアリーズの昇天のフィールド神経科学研究所から来ました.

Materials

4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) IHC world, Woodstock, MD
Aanimal model of Alzheimer's disease Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME
Absolute alcohol VWR,Radnor, PA
Alexa 594 Santacruz Biotech, Dallas, TX
Antibody 6E10 Biolegend, San Diego, CA
Antibody A11 Millipore, Burlington, MA
Compound light microscope Olympus, Shinjuku, Japan Olympus BX51
Congo red Sigma, St. Louis, MO
Cryostat GMI, Ramsey, MN LeicaCM1800
Curcumin Sigma, St. Louis, MO
Disodium hydrogen phosphate Sigma, St. Louis, MO
Dystyrene plasticizer xylene BDH, Dawsonville, GA
Filter papers Fisher scientific, Pittsburgh, PA
Hoechst-33342 Sigma, St. Louis, MO
Inverted fluorescent microscope Leica, Buffalo Grove, IL Leica DMI 6000B
Inverted fluorescent microscope Olympus, Shinjuku, Japan Olympus 1×70
Normal goat serum Sigma, St. Louis, MO
Paraffin Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehyde Sigma, St. Louis, MO
Ploy-lysine coated charged glass slide Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ
Potassium chloride Sigma, St. Louis, MO
Potassium dihydrogen phosphate Sigma, St. Louis, MO
Sodium azide Sigma, St. Louis, MO
Sodium chloride Sigma, St. Louis, MO
Sodium hydroxide EMD Millipore, Burlington, MA
Sodium pentobarbital Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Thioflavin-S Sigma, St. Louis, MO
Triton-X-100 Sigma, St. Louis, MO
Xylene VWR,Radnor, PA

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Maiti, P., Plemmons, A., Bowers, Z., Weaver, C., Dunbar, G. Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin. J. Vis. Exp. (153), e60377, doi:10.3791/60377 (2019).

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